李泮霖，劉宏，廖弈秋，李沛波，姚宏亮，蘇薇薇

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院∥廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心∥廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510275)

丹紅注射液由丹參、紅花兩味藥組成，具有活血化瘀、通脈舒絡(luò)的功效，臨床上用于瘀血閉阻所致的胸痹及中風(fēng)，冠心病、心絞痛、心肌梗塞，瘀血型肺心病，缺血性腦病、腦血栓。由其功能主治可以看出，抗血栓作用是丹紅注射液發(fā)揮藥效的關(guān)鍵?，F(xiàn)代研究表明，在激光誘導(dǎo)的大鼠動(dòng)脈血栓模型[1]和大鼠急性血瘀模型[2]中，丹紅注射液均顯示出很好的抗血栓、溶栓作用；對(duì)其相關(guān)的藥理作用機(jī)制，也進(jìn)行了一些初步探討[3-4]。但是，目前的研究仍僅關(guān)注單個(gè)或少數(shù)幾個(gè)指標(biāo)及蛋白的變化，未能對(duì)其多成分多靶點(diǎn)作用機(jī)制進(jìn)行解釋。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)整合了化學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物數(shù)據(jù)，使用計(jì)算模擬建立藥理學(xué)性質(zhì)預(yù)測(cè)模型，為闡明中藥復(fù)方制劑多成分、多靶點(diǎn)作用機(jī)制及其相應(yīng)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了一種可行的方法[5]。本研究采用Surflex-Dock分子對(duì)接方法，研究丹紅注射液化學(xué)成分與抗血栓靶點(diǎn)間的相互作用，并建立其化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，為闡明丹紅注射液抗血栓作用的分子機(jī)制提供依據(jù)。本研究對(duì)于豐富丹紅注射液的科學(xué)內(nèi)涵，指導(dǎo)其臨床用藥具有實(shí)際意義。

1 方 法

1.1 化學(xué)成分

前期已采用UFLC-PDA-Triple TOF-MS/MS技術(shù)[2]，確證及指證了丹紅注射液中的82個(gè)化學(xué)成分，并明確了各成分的藥材歸屬。通過(guò)檢索NCBI PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.ncbi.nlm.nih. gov/pccompound)及Chemical Book 數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.chemicalbook.com)，獲得各化學(xué)成分的分子結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)文件均儲(chǔ)存為mol格式，作為分子對(duì)接的配體。

1.2 抗血栓作用相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)

前期已建立了抗血栓作用相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)[6]，該數(shù)據(jù)庫(kù)由115個(gè)候選蛋白質(zhì)靶點(diǎn)組成，其X射線晶體結(jié)構(gòu)從RCSB Protein Data Bank(http:∥www. pdb.org/)中下載，作為分子對(duì)接的受體。

1.3 分子對(duì)接

采用計(jì)算機(jī)模擬分子對(duì)接方法，以蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)為中心，參考缺省參數(shù)進(jìn)行各化學(xué)成分與各候選蛋白靶點(diǎn)的分子模擬對(duì)接。以Surflex-Dock預(yù)測(cè)的分子受體和配體的最佳對(duì)接姿態(tài)的結(jié)合能作為評(píng)價(jià)參數(shù)，將與每個(gè)分子配體(各化學(xué)成分)結(jié)合能大于6的分子受體(各候選蛋白靶點(diǎn))作為陽(yáng)性結(jié)果(潛在靶點(diǎn))，用于構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)[6]。

1.4 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

利用Cytoscape3.3.0軟件(http:∥www.cytoscape.org/)對(duì)計(jì)算結(jié)果進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。應(yīng)用Cytoscape軟件中的ClueGO插件，對(duì)丹紅注射液抗血栓作用相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析，設(shè)定P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 丹紅注射液成分與抗血栓作用相關(guān)靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果

將丹紅注射液82個(gè)化學(xué)成分，分別與抗血栓相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)中的115個(gè)蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果表明：丹紅注射液中有60個(gè)成分與106個(gè)抗血栓作用靶點(diǎn)間存在2 028條關(guān)聯(lián)(表1、表2)，使用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建了成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)。

從表1可以看出，在與丹紅注射液成分有關(guān)聯(lián)的潛在靶點(diǎn)中，與血栓形成關(guān)聯(lián)密切的重要靶點(diǎn)排名均很靠前，包括F2(凝血因子Ⅱ)、REN(腎素)、F13A(凝血因子X(jué)IIIa)、PROC(蛋白C—凝血因子Ⅴa及Ⅷa抑制劑)、PGH2(前列腺素G/H合酶2)、ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)、PLAU(尿激酶型纖溶酶原激活物)和SERPINC1(抗凝血酶)等，這些靶點(diǎn)分別涉及凝血、纖溶系統(tǒng)以及血管生成、收縮舒張等多個(gè)系統(tǒng)，提示這些靶點(diǎn)是丹紅注射液的主要藥效靶點(diǎn)。

表1 丹紅注射液的潛在抗血栓作用靶點(diǎn)(關(guān)聯(lián)化合物數(shù)≥35)Table 1 The potential anti-thrombotic targets of Danhong Injection

從表2可以看出，丹紅注射液中丹酚酸類(lèi)成分與大多數(shù)血栓靶點(diǎn)均有較好的結(jié)合，表明丹酚酸類(lèi)是丹紅注射液抗血栓作用的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

表2 丹紅注射液的抗血栓活性成分Table 2 The anti-thrombotic compounds in Danhong Injection

續(xù)表2

1) 化合物編號(hào)與文獻(xiàn)[2]一致

同時(shí)，通過(guò)ClueGO插件對(duì)丹紅注射液抗血栓作用靶點(diǎn)涉及的KEGG信號(hào)通路進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，丹紅注射液抗血栓作用靶點(diǎn)主要富集于Complement and coagulation cascades、cAMP signaling pathway、Calcium signaling pathway、Fluid shear stress and atherosclerosis、Renin-angiotensin system信號(hào)通路等。

圖1 丹紅注射液成分-抗血栓作用相關(guān)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(化合物編號(hào)對(duì)應(yīng)的化合物名稱(chēng)見(jiàn)表2)Fig.1 The compound-antithrombotic target network of Danhong Injection( The compound name corresponding to the compound No. was showed in Table 2)

2.2 丹紅注射液指紋圖譜色譜峰的靶點(diǎn)分析

前期我們構(gòu)建了丹紅注射液生物活性指紋圖譜[2]，包括13個(gè)主要色譜峰，分別為5-羥甲基糠醛(1)、丹參素(2)、原兒茶醛(3)、羥基紅花黃色素A(4)、對(duì)香豆酸(5)、丹酚酸H(6)、丹酚酸I(7)、丹酚酸D(8)、紫草酸甲酯(9)、迷迭香酸(10)、紫草酸(11)、丹酚酸B(12)、丹酚酸A(13)。因此，對(duì)這13個(gè)色譜峰的相關(guān)靶點(diǎn)作進(jìn)一步分析(圖3)。

圖2 丹紅注射液抗血栓作用的成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖(化合物編號(hào)對(duì)應(yīng)的化合物名稱(chēng)見(jiàn)表2)Fig.2 The compound-antithrombotic target-signaling pathway network of Danhong Injection(The compound name corresponding to the compound No. was showed in Table 2)

圖3 丹紅注射液13個(gè)指紋圖譜色譜峰的靶點(diǎn)分析1: 5-羥甲基糠醛; 2: 丹參素; 3: 原兒茶醛; 4: 羥基紅花黃色素A; 5: 對(duì)香豆酸；6: 丹酚酸H；7: 丹酚酸I；8: 丹酚酸D；9: 紫草酸甲酯；10: 迷迭香酸；11: 紫草酸；12: 丹酚酸B；13: 丹酚酸AFig.3 The target analysis of 13 main compounds in Danhong Injection1：5-Hydroxymethyl furfural；2：Danshensu；3：Protocatechualdehyde；4：Hydroxysafflor yellow A；5： p-Coumaric acid；6：Salvianolic acid H；7：Salvianolic acid I；8：Salvianolic acid D；9：Monomethyl lithospermate；10：rosmarinic acid；11：Lithospermic acid；12：Salvianolic acid B；13：Salvianolic acid A

結(jié)果表明，13個(gè)色譜峰與凝血、纖溶系統(tǒng)以及血管生成、收縮舒張等多個(gè)系統(tǒng)的靶點(diǎn)具有相互關(guān)聯(lián)。關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)較多的成分為丹酚酸A(13)、迷迭香酸(10)、丹酚酸H(6)、丹酚酸I(7)、丹酚酸D(8)、丹酚酸B(12)；而5-羥甲基糠醛(1)、原兒茶醛(3)、對(duì)香豆酸(5)關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)個(gè)數(shù)較少，說(shuō)明其對(duì)抗血栓藥效貢獻(xiàn)較小。

3 討 論

通過(guò)本研究，得出106個(gè)蛋白靶點(diǎn)與60個(gè)丹紅成分間存在2 028個(gè)相互作用。其中，F(xiàn)2、F13A、SERPINC1、PGH2、ACE、REN、PLAU和PROC是已知與血栓形成密切相關(guān)、且與丹紅注射液化學(xué)成分有較強(qiáng)結(jié)合的靶點(diǎn)；在抗血栓活性成分中，丹酚酸類(lèi)成分占主導(dǎo)地位。

F2、F13A同為凝血因子，通過(guò)外源性和內(nèi)源性凝血途徑的級(jí)聯(lián)傳遞介導(dǎo)凝血酶原酶復(fù)合物的形成、凝血酶原的轉(zhuǎn)變以及最終的凝血過(guò)程和血栓形成；其中F2在整個(gè)過(guò)程中發(fā)揮著核心作用[7]。SERPINC1是血漿中最重要的抗凝物質(zhì)之一，可抑制50%～60%的凝血酶和凝血因子Ⅶa、Ⅸa、Ⅹa、Ⅺ、Ⅻa的激活，從而阻止血液凝固。PGH2可以影響花生四烯酸誘導(dǎo)的血小板聚集和血栓形成[8]。除了上述凝血和抗凝系統(tǒng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)，丹紅注射液抗血栓作用的主要靶點(diǎn)還包括腎素-血管緊張素系統(tǒng)中的REN和ACE，與血壓的穩(wěn)定和調(diào)節(jié)直接相關(guān)[9]。研究表明，ACE作為RAS系統(tǒng)最主要的成員，除介導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞收縮引起血壓升高外，還介導(dǎo)血管壁的慢性炎癥反應(yīng)，進(jìn)而參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展[10]。此外，丹紅注射液還與纖溶系統(tǒng)的PLAU和PROC靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)密切。PLAU作為纖溶酶原的激活劑，通過(guò)激活PLG(纖溶酶原)為纖溶酶發(fā)揮溶栓作用。PROC可同時(shí)作用于抗凝系統(tǒng)及纖溶系統(tǒng)，其被激活后，在磷脂和Ca2+存在時(shí)，可滅活FⅤa、FⅧa；阻礙FⅩa與血小板上的磷脂結(jié)合，削弱FⅩa對(duì)凝血酶原的激活作用；刺激纖溶酶原激活物釋放，增強(qiáng)纖溶酶活性，促進(jìn)纖維蛋白溶解[11]。

靶點(diǎn)信號(hào)通路分析結(jié)果顯示，丹紅注射液活性成分相關(guān)的作用靶點(diǎn)主要參與Complement and coagulation cascades、cAMP signaling pathway、Calcium signaling pathway、Fluid shear stress and atherosclerosis、Renin-angiotensin system等信號(hào)通路。這些通路涉及凝血功能、內(nèi)皮功能、血管收縮舒張等多個(gè)方面，共同維護(hù)機(jī)體血液循環(huán)系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡，抑制血栓形成或出血[12]。丹紅注射液同一成分或不同成分同時(shí)作用于多個(gè)通路的靶點(diǎn)，也體現(xiàn)了中成藥多成分、多靶點(diǎn)、綜合調(diào)控的作用特點(diǎn)。

中藥成分復(fù)雜，單個(gè)成分在體內(nèi)的濃度往往達(dá)不到其有效濃度[13]，但在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床中，又可觀察到較好的療效。本研究中，丹紅注射液多個(gè)成分同時(shí)與凝血通路中的不同靶點(diǎn)相互作用，可能由此引發(fā)凝血級(jí)聯(lián)效應(yīng)而發(fā)揮藥效。整體藥效到底是由于不同成分間的相互協(xié)同、加和還是拮抗，尚有待進(jìn)一步研究。

在丹紅注射液指紋圖譜13個(gè)主要色譜峰中，丹參素(2)、羥基紅花黃色素A(4)、對(duì)香豆酸(5)、丹酚酸I(7)、丹酚酸D(8)、紫草酸甲酯(9)、迷迭香酸(10)、紫草酸(11)、丹酚酸B(12)、丹酚酸A(13)為核心活性成分群[2]。本研究中，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明，丹酚酸A(13)、迷迭香酸(10)、丹酚酸H(6)、丹酚酸I(7)、丹酚酸D(8)、丹酚酸B(12)關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)較多。兩種方法獲得的丹紅活血化瘀活性成分基本一致，可以相互印證。本研究為進(jìn)一步闡明丹紅注射液多成分、多靶點(diǎn)分子作用機(jī)制提供了依據(jù)。