李 彪，倪偉超，倪 穗

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

殼聚糖是甲殼素脫乙酰的產(chǎn)物，是一種可生物降解材料，由于自身的正電荷可以干擾微生物細胞表面的負電荷進行物質(zhì)交換，導(dǎo)致細胞膜破裂，從而具有一定的抑菌性。殼聚糖不溶于水，溶于多數(shù)有機酸形成粘稠液體并具有良好的成膜性，同時殼聚糖具有良好的生物相容性，研究人員曾把茶多酚、石榴皮提取物、薄荷提取物和花青素等天然活性物質(zhì)與殼聚糖混合研制出具備一定性質(zhì)的保鮮膜的研究[1-2]，其具有很大的應(yīng)用價值。香榧假種皮精油是天然的活性物質(zhì)，具有較強的抑菌性和抗氧化性，結(jié)合殼聚糖的成膜性，研制出一種果蔬保鮮劑具有很大的開發(fā)潛力。

香榧(TorreyagrandisFort. ex Lindl. cv. Merrillii)是紅豆杉科(Taxaceae)榧屬(Torreya)植物，其種子是我國特有的珍稀干果。香榧營養(yǎng)價值很高，富含脂肪、蛋白質(zhì)、糖分以及鈣、鉀、鋅、磷等多種礦物元素，還含有多種維生素和17種氨基酸[3]，香榧假種皮中含有多種黃酮類化合物、醇、醛、烯等植物芳香類物質(zhì)，具有較強的抗氧化活性[4]。動物實驗表明，香榧假種皮提取物具有消炎作用[5]。同時，這類植物精油對微生物具有廣譜性、高效性，具有很強的殺菌作用，可以有效的殺死多種果蔬表面的有害微生物，結(jié)合殼聚糖的成膜性，兩者搭配使用則是一種安全無毒的天然保護劑。李湘利[6]等研究了姜蒜浸取液與殼聚糖復(fù)合保鮮劑對切分蓮藕的護色效果，結(jié)果表明復(fù)合保鮮劑可顯著抑制切分蓮藕貯藏期間的PPO和MDA的積累，延長貨架期。陶永元[7]等利用殼聚糖與茶多酚復(fù)配對草莓進行保鮮，結(jié)果表明明顯降低草莓的失重率、腐爛指數(shù)、呼吸強度，延緩果實的維生素C、可滴定酸、可溶性糖含量的下降，保持較好的感官品質(zhì)。茶多酚與殼聚糖復(fù)合物對草莓具有明顯的保鮮效果。

本論文研究內(nèi)容是以殼聚糖為成膜機制，甘油為增塑劑，再添加香榧假種皮精油這種天然物質(zhì)，以期制備出一種抗菌抗氧化的果蔬保鮮劑。通過響應(yīng)面設(shè)計實驗，探究殼聚糖、香榧假種皮精油、甘油三者之間不同配比對抑菌性和抗氧化性的影響，利用Design-Expert軟件優(yōu)化得出復(fù)合涂膜的最佳配比，為工業(yè)化生產(chǎn)殼聚糖/香榧假種皮精油復(fù)合涂膜保鮮劑提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

殼聚糖，脫乙酰度為95%，購買自廈門藍灣科技有限公司。香榧假種皮精油采用水蒸氣蒸餾法獲得。甘油(丙三醇)、冰醋酸、乳酸、吐溫-80等均為分析純藥品。

1.2 實驗設(shè)備

揮發(fā)油提取裝置(鄭州中天實驗儀器有限公司)；電爐，多功能粉碎機(上海江信科技有限公司)；電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；超凈工作臺(天津市泰勒斯儀器有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰勒斯儀器有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計(北京普系統(tǒng)用儀器有限公司)；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.3 復(fù)合涂膜的制備工藝

按照實驗配比，分別將一定量的殼聚糖溶于含有1%乙酸和1%的乳酸溶液中，將一定量的香榧假種皮精油添加到溶液中，再加入一定量的甘油和0.2%吐溫-80，攪拌至完全溶解。

1.4 單因素實驗的設(shè)計

固定殼聚糖濃度為2%，甘油濃度為2%，比較不同的香榧假種皮精油濃度(0，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7%)對復(fù)合涂膜的抑菌性和總酚含量的影響。

固定香榧假種皮精油濃度為0.6%，甘油濃度為2%，比較不同的殼聚糖濃度(0，1%，1.5%，2%，2.5%，3%)對復(fù)合涂膜的抑菌性和總酚含量的影響。

固定香榧假種皮精油濃度為0.6%，殼聚糖濃度為2%，比較不同的甘油濃度(0，2%，3%，4%，5%)對復(fù)合涂膜的抑菌性的影響。

1.5 雙響應(yīng)面法優(yōu)化殼聚糖/香榧假種皮精油復(fù)合涂膜保鮮劑的配比

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)響應(yīng)面法的中心組合實驗(Box-Beknken)設(shè)計，挑選出香榧假種皮精油濃度(X1)、殼聚糖濃度(X2)、甘油濃度(X3)三個因素，以-1、0、1分別表示三個因素的低、中、高三個水平，并以保鮮劑中總酚含量(Y1)和抑菌圈大小(Y2)為兩個響應(yīng)值。響應(yīng)面分析因素及水平如表1所示，每組實驗重復(fù)三次，取平均值。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平

1.6 總酚含量的測定

沒食子酸標準曲線的制備：準確稱取沒食子酸標準品25 mg，去離子水溶解定容至250 mL，得到對照品標準溶液。精準吸取對照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于10 mL容量瓶中，再加入2.5 mL、10%的福林酚顯色劑，搖勻，5 min后再加入2 mL、7.5% Na2CO3溶液，定容至10 mL。室溫下反應(yīng)1 h后測定溶液在765nm處的吸收峰。標準曲線方程為Y=0.094 5+0.023 5，R2=0.999 5。

按照制備標準曲線的方法測定總酚含量，準確吸取保鮮劑液體1mL，加入2.5 mL去離子水，再加入2.5 mL、10%的福林酚顯色劑，搖勻，5 min后再加入2 mL、7.5% Na2CO3溶液，定容至10 mL。室溫下反應(yīng)1 h后測定溶液在765 nm處的吸收峰。取3個平行組，每組測3次。

1.7 抑菌圈的測定

菌種的活化：金黃色葡萄球菌經(jīng)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面(37±1)℃培養(yǎng)24 h活化，挑取單菌落接入無菌新鮮液體培養(yǎng)基(37±1)℃培養(yǎng)24 h，用接種環(huán)挑取1環(huán)在平板上劃線培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，然后挑取單菌落，采用十倍稀釋法將菌液稀釋至所需濃度。

用無菌移液槍吸取0.1 mL菌懸液(菌液濃度106cfu/mL)，加入已倒好培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中涂布均勻。每個培養(yǎng)皿放置已滅菌的牛津杯2個，在每個牛津杯中加入300 μL配置好的保鮮劑。將培養(yǎng)皿置于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，采用十字交叉法測定抑菌圈直徑。每組試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 香榧假種皮精油濃度對復(fù)合涂膜的抑菌性和總酚含量的影響

在殼聚糖濃度為2%，甘油濃度為2%的條件下，不同精油濃度對復(fù)合涂膜的抑菌性和總酚含量的影響如圖1所示。

圖1 精油濃度對復(fù)合涂膜的抑菌性和總酚含量的影響

由圖1可知，隨著精油濃度的升高，復(fù)合涂膜的總酚含量在升高，抑菌性也在增強。當精油濃度0.6%時，復(fù)合涂膜的總酚含量和抑菌性增加非常緩慢，因此綜合考慮到精油資源的珍貴性，精油的最佳濃度選取為0.6%。

2.1.2 殼聚糖濃度對復(fù)合涂膜的抑菌性和總酚含量的影響

在香榧假種皮精油濃度為0.6%，甘油濃度為2%的條件下，不同殼聚糖濃度對復(fù)合涂膜的抑菌性和總酚含量的影響如圖2所示。

圖2 殼聚糖濃度對復(fù)合涂膜的抑菌性和總酚含量的影響

由圖2可知，隨著殼聚糖濃度的增大，復(fù)合涂膜的總酚含量和抑菌性都呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢。當殼聚糖濃度超過2%時，復(fù)合涂膜的總酚含量和抑菌性開始下降，可能是由于殼聚糖濃度過高，使得液體粘稠性過大，精油無法與殼聚糖溶液完全的溶合。因此，最佳的殼聚糖濃度為2%。

2.1.3 甘油濃度對復(fù)合涂膜的抑菌性的影響

在香榧假種皮精油濃度為0.6%，殼聚糖濃度為2%的條件下，不同甘油濃度對復(fù)合涂膜的抑菌性的影響如圖3所示。

圖3 甘油濃度對復(fù)合涂膜的抑菌性的影響

由圖3所示，隨著甘油濃度的增大，復(fù)合涂膜的抑菌性能呈現(xiàn)出增加趨勢，但是當甘油濃度大于2%時，復(fù)合涂膜的抑菌性就開始下降，因此最佳的甘油濃度為2%。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化殼聚糖/香榧假種皮精油復(fù)合涂膜保鮮劑的配比

在前期單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取了香榧假種皮精油濃度(X1)、殼聚糖濃度(X2)、甘油濃度(X3)三個因素作為變量，以復(fù)合涂膜的總酚含量(Y1)和抑菌性(Y2)作為兩個響應(yīng)值，其設(shè)計方案及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果

為了明確各因素對響應(yīng)值的影響，對表2進行數(shù)據(jù)回歸擬合，得到復(fù)合涂膜的總酚含量和抑菌性與三個因素之間的二次方程模型：Y=2.46+0.072X1-6.25×10-4X2+0.032X3-0.058X1X2-0.014X1X3-0.059X2X3-0.12X12-0.19X22-0.14X32。

從表3可以看出，該模型的F值為13.88，P=0.001 1<0.01，說明了該模型極顯著，具有統(tǒng)計學(xué)的意義，且回歸模型的失擬項P=0.149 3>0.05差異檢驗不顯著，表明所選用的二次回歸方程模型與實驗數(shù)據(jù)擬合較好，實驗誤差小?；貧w方程的擬合程度可以通過決定系數(shù)R2和校正決定系數(shù)RAdj2來驗證。該模型決定系數(shù)R2=0.946 9，校正決定系數(shù)RAdj2=0.932 8，表明該模型擬合程度良好。因此該模型方程可用于優(yōu)化殼聚糖/香榧假種皮精油復(fù)合涂膜保鮮劑的配比。

表3 回歸方程方差分析

由表3中方差分析結(jié)果可知，在所選因素水平范圍內(nèi)對復(fù)合涂膜配比的影響大小順序為X1>X2>X3，即精油濃度>殼聚糖濃度>甘油濃度。該模型中一次項X1(精油濃度)對模型有極顯著的影響，X2(殼聚糖濃度)對模型有顯著影響，X3(甘油濃度)對模型影響不顯著；二次項X12、X22、X32對模型都有極顯著的影響；交互項X1X2、X1X3、X2X3之間的交互作用都不顯著，表明各因素對復(fù)合涂膜最佳配比的影響并不是簡單的線性關(guān)系。

2.3 殼聚糖/香榧假種皮精油復(fù)合涂膜保鮮劑的最佳配比的確定與驗證

根據(jù)模型多元回歸方程所作的響應(yīng)面曲線及等高線圖見圖4～9，可以直觀的反應(yīng)各因素之間的交互作用。6個曲面均為開口向下的凸形曲面，因素X1、X2、X3與復(fù)合涂膜的總酚含量和抑菌性均呈現(xiàn)拋物線關(guān)系，且存在考察范圍內(nèi)的極大值。

對所得到的模型回歸方程3個自變量取一階偏導(dǎo)數(shù)等于零，可得X1=0.7、X2=2.01、X3=2.14，因此根據(jù)響應(yīng)面分析結(jié)果預(yù)測殼聚糖/香榧假種皮精油復(fù)合涂膜保鮮劑的配比的最優(yōu)條件為精油濃度為0.7%、殼聚糖濃度為2.01%，甘油濃度為2.14%，在此條件下預(yù)測的總酚含量為31.61×10-3mg/mL，抑菌圈為2.42 cm。

圖4精油濃度和殼聚糖濃度對復(fù)合涂膜總酚含量影響的等高線和三維曲面

未檢驗此結(jié)果的準確性，采用上述工藝條件進行總酚含量和抑菌性的實驗。香榧假種皮精油濃度為0.7%，殼聚糖濃度為2.01%，甘油濃度為2.14%配制的復(fù)合涂膜進行實驗，得到的總酚含量為30.23×10-3mg/mL，與預(yù)測值的誤差為4.37%，抑菌圈為2.35 cm，與預(yù)測值的誤差為2.89%。因此，該模型得到的殼聚糖/香榧假種皮精油復(fù)合涂膜保鮮劑的最佳配比準確可靠，具有實用價值。

3 結(jié) 論

殼聚糖以其獨有的無毒性、可降解性、廣譜抗菌性和成膜性等特點，被廣泛的應(yīng)用于果蔬保鮮，延長貨架期等領(lǐng)域。本章內(nèi)容就是利用殼聚糖的特點來制備出一種抗菌抗氧化的果蔬保鮮劑。

在單因素的基礎(chǔ)上，采用了響應(yīng)面法對殼聚糖/香榧假種皮精油復(fù)合涂膜保鮮劑的配比進行優(yōu)化以其得到低成本高效的保鮮劑。選取香榧假種皮精油濃度、殼聚糖濃度、甘油濃度作為自變量，以復(fù)合涂膜中的總酚含量和抑菌性作為響應(yīng)值，采用 Box-Behnken進行三因素三水平試驗設(shè)計。結(jié)果表明：精油濃度對復(fù)合涂膜有極顯著影響，殼聚糖濃度對復(fù)合涂膜有顯著影響，甘油濃度對復(fù)合涂膜影響不顯著，三個因素對保鮮劑的影響大小順序依次為香榧假種皮精油濃度>殼聚糖濃度>甘油濃度；殼聚糖/香榧假種皮精油復(fù)合涂膜保鮮劑的最佳配比是香榧假種皮精油濃度為0.7%，殼聚糖濃度為2.01%，甘油濃度為2.14%，在此條件下復(fù)合涂膜的總酚含量為30.23×10-3mg/mL，與預(yù)測值的誤差為4.37%，抑菌圈為2.35 cm，與預(yù)測值的誤差為2.89%。

總之，優(yōu)化后的復(fù)合涂膜弄夠合理的使用精油資源，不僅使香榧假種皮這種資源不再污染環(huán)境，而且還可以給農(nóng)民帶來一定的收入，最主要的是添加到了保鮮劑中可以有效地抑制果蔬上微生物的生長，減少浪費。