李堅 ，湯佳，莊莉，許杰龍*

1.中國科學院廣州地球化學研究所，廣東 廣州 510640；2. 中國科學院大學，北京 100039；3.廣東省生態(tài)環(huán)境技術研究所，廣東 廣州 510650；4. 廈門市環(huán)境科學研究院，福建 廈門 361006

長期以來，微生物互營過程中的電子轉移機制是“種間氫轉移”或“種間甲酸轉移”，互營微生物以“氫氣”或“甲酸”作為電子載體進行微生物間的電子傳遞（劉鵬飛等，2013；Stams et al.，2009；Sieber et al.，2012）?！胺N間直接電子傳遞”（direct interspecies electron transfer，DIET）是最新被發(fā)現(xiàn)的一種互營機制，它與傳統(tǒng)“種間氫轉移”或“種間甲酸轉移”的本質(zhì)區(qū)別在于互營微生物之間的電子轉移不依賴化學物質(zhì)作為載體，而是通過微生物自身產(chǎn)生的導電性鞭毛、分泌的細胞色素或外源導電物質(zhì)進行直接電子傳遞（Shrestha et al.，2014；Lovley，2017a，2017b）。在DIET過程中，電子傳遞不受氫氣或甲酸擴散速度的影響，極大地提高了電子傳遞效率，且簡單直接的傳遞步驟為微生物節(jié)省更多能量，節(jié)省的能量可供自身生長利用，因而具有“經(jīng)濟”與“高效”的特點（Lovley，2011a，2011b，2011c）。DIET可能是微生物為提高互營協(xié)作效率進化形成的一種有效的電子傳遞方式，是研究微生物互營過程及機制的新思路。

目前，研究者們提出了 3種可能的種間直接電子傳遞方式：（1）導電性菌毛（納米導線），比如地桿菌（Geobacter）產(chǎn)生的菌毛具有類似金屬的導電性，與互營微生物形成的團聚體具有導電性，電子供體微生物產(chǎn)生電子通過菌毛直接傳遞至電子受體微生物（Summers et al.，2010；Shrestha et al.，2013；Rotaru et al.，2014a，2014b）；（2）細胞色素 c，比如甲烷氧化菌 ANME-2氧化甲烷產(chǎn)生的電子通過外膜細胞色素 c傳遞至胞外，然后通過細胞間隙的細胞色素將電子直接傳遞至硫酸還原菌的外膜細胞色素（McGlynn et al.，2015）；（3）導電物質(zhì)，以具有導電性的顆粒物質(zhì)作為電子供體微生物和電子受體微生物之間直接電子傳遞的“導管”，目前已證實具有這種功能的導電物質(zhì)有導電性鐵氧化物、生物炭、活性炭等（Liu et al.，2012，2015；Chen et al.，2014a，2014b；Tang et al.，2016）。

目前關于 DIET的報道主要集中在地桿菌和地桿菌之間，以及地桿菌與產(chǎn)甲烷菌之間的互營過程。已證實具有DIET功能的微生物主要包括Geobacter metallireducens、 Geobacter sulfurreducens、Methanosarcina barkeri和 Methanosaeta harundinacea（Lovley，2017a，2017b）。Morita et al.（2011）首次在啤酒廢水厭氧污泥床的顆粒污泥中發(fā)現(xiàn)了DIET介導的產(chǎn)甲烷過程，因為顆粒污泥中H2/甲酸介導的產(chǎn)甲烷速率遠遠低于乙醇降解速率，作者推測體系中可能還存在其他互營途徑，由于顆粒污泥中微生物形成的團聚體具有“類金屬”的強導電性，因此作者提出直接電子傳遞在互營產(chǎn)甲烷過程中的可能性，并推測團聚體中的主要細菌Geobacter通過自身的導電性菌毛與產(chǎn)甲烷菌Methanosaeta進行直接電子傳遞。Rotaru et al.（2014a）通過Geobacter metallireducens和Methanosarcina barkeri和Geobacter metallireducens和Methanosaeta harundinacea（Rotaru et al.，2014b）純菌共培養(yǎng)體系，進一步直接證實了DIET介導的乙醇互營氧化產(chǎn)甲烷過程。

目前已證實的地桿菌與產(chǎn)甲烷菌之間的直接電子傳遞都以乙醇為電子供體，在乙醇互營氧化產(chǎn)甲烷過程中，Geobacter氧化乙醇產(chǎn)生的電子通過導電性菌毛直接傳遞至產(chǎn)甲烷菌還原 CO2產(chǎn)生甲烷，這個過程產(chǎn)生的中間產(chǎn)物乙酸由乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌利用而產(chǎn)生甲烷。乙酸是有機物厭氧降解產(chǎn)甲烷過程中的重要中間產(chǎn)物，盡管 Kato et al.（2012a）認為當導電性磁鐵礦/赤鐵礦存在時，Geobacter氧化乙酸產(chǎn)生的電子能直接傳遞給Methanosarcina還原CO2產(chǎn)生甲烷，但還未在純菌共培養(yǎng)體系中得到驗證。本實驗以具有DIET功能的 Geobacter sulfurreducens和 Methanosarcina barkeri為研究對象，構建Geobacter sulfurreducens和Methanosarcina barkeri共培養(yǎng)體系，以生物炭的導電性為切入點，研究共培養(yǎng)體系中乙酸產(chǎn)甲烷的代謝過程和電子傳遞途徑，以期為揭示DIET對乙酸產(chǎn)甲烷過程的影響機制和溫室氣體排放或清潔能源生產(chǎn)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 微生物、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

實驗所用的微生物分別為 Geobacter sulfurreducens（DSM12127）和 Methanosarcina barkeri（DSM800），購買于德國菌種保藏中心（DSMZ）。Geobacter sulfurreducens的培養(yǎng)基為NBAF（Coppi et al.，2001），Methanosarcina barkeri培養(yǎng)基為120（Bryant et al.，1987）。所有的培養(yǎng)操作都是在嚴格厭氧條件下進行，培養(yǎng)基在121 ℃滅菌20 min后，通入N2/CO2（80%∶20%）混合氣1 h至形成充分厭氧狀態(tài)。以10 mmol·L-1乙酸作為電子供體，40 mmol·L-1延胡索酸作為電子受體在NBAF培養(yǎng)基中培養(yǎng)Geobacter sulfurreducens；以乙酸為產(chǎn)甲烷基質(zhì)在 120培養(yǎng)基中培養(yǎng) Methanosarcina barkeri。Geobacter sulfurreducens和 Methanosarcina barkeri的培養(yǎng)溫度分別為30 ℃和37 ℃。

1.2 生物炭的制備及理化性質(zhì)的測定

所用的生物炭以水稻秸稈為原料制備，炭化前先將水稻秸稈的穗部、葉子和根部去除，莖稈部分剪成2～3 cm長的小片段，置于烘箱中80 ℃下烘干。將預處理后的水稻秸稈裝入石英管（長1.2 m，內(nèi)徑7 cm）后，管口密封并通入氮氣（1.5 L·min-1），然后置于電阻爐上以20 ℃·min-1的速率加熱至恒定的溫度（本實驗用400 ℃和900 ℃）并維持1 h。持續(xù)通N2條件下自然冷卻至室溫后，用蒸餾水清洗去除雜質(zhì)，105 ℃烘干干燥，研磨成約0.15 mm大小的碳顆粒，并過100目篩子，于干燥器中貯存?zhèn)溆谩?/p>

生物炭的元素組成用元素分析儀（Vario EL Cube，Elementar Co.，德國）測定（Yu et al.，2015）；電導率的測定方法參照Mochidzuki et al.（2003）和Xu et al.（2013）提出的雙探針床法進行測定，具體而言，雙探針床由壓力裝置、手持歐姆表和帶有兩個不銹鋼活塞(分別位于頂部和底部)的圓柱形鐵床構成，鐵床的內(nèi)表面內(nèi)嵌聚丙烯材料，與生物炭完全絕緣，大約放置1.0 g的生物炭于鐵床內(nèi)，在施加4 MPa的高壓時，記錄整個鐵床的電阻即可得到該生物炭的電導率；表面官能團通過紅外光譜儀（NICOLET iS50FT-IR Thermo）進行測定。

本文中生物炭-1是指在 900 ℃炭化的秸稈生物炭，生物炭-2是指在400 ℃炭化的秸稈生物炭。

在培養(yǎng)實驗中，生物炭加入培養(yǎng)基溶液后于121 ℃滅菌20 min。

1.3 共培養(yǎng)實驗

構建共培養(yǎng)體系前分別培養(yǎng) Geobacter sulfurreducens和Methanosarcina barkeri，收集對數(shù)生長期的微生物，離心后（8000 r·min-1，10 min）棄去上清液，重新懸浮于新鮮的不含有電子供體和電子受體的培養(yǎng)基中，重復操作3次。共培養(yǎng)體系在20 mL厭氧管中進行，其中含有6 mL培養(yǎng)基、0.5 mL Geobacter sulfurreducens和 0.5 mL Methanosarcina barkeri以及25 mmol乙酸，通入混合氣除氧后密封，置于 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光靜止培養(yǎng)。

不同導電性生物炭對產(chǎn)甲烷過程的影響實驗設計處理如下：（1）Geobacter sulfurreducens+Methanosarcina barkeri（biochar-free）；（2）Geobacter sulfurreducens+Methanosarcina barkeri+12 g·L-1導電或非導電生物炭（12 g·L-1）；（3）Geobacter sulfurreducens+Methanosarcina barkeri+25 g·L-1導電或非導電生物炭（25 g·L-1）；（4）Geobacter sulfurreducens+Methanosarcina barkeri+50 g·L-1導電或非導電生物炭（50 g·L-1）。培養(yǎng)過程中，定點采樣監(jiān)測甲烷產(chǎn)量和微生物生長量。導電生物炭促進乙酸互營氧化產(chǎn)甲烷的實驗設計如下：（1）Geobacter sulfurreducens+Methanosarcina barkeri+25 g·L-1導電或非導電生物炭（MB+25 g·L-1biochar-1+GS，MB+25 g·L-1biochar-2+ GS）；（2）Methanosarcina barkeri+導電或非導電 25 g·L-1生物炭（MB+25 g·L-1biochar-1，MB+25 g·L-1biochar-2）。培養(yǎng)過程中定點監(jiān)測甲烷產(chǎn)量和微生物生長量，并在培養(yǎng)結束后通過掃描電鏡觀察添加導電生物炭的共培養(yǎng)體系中 Geobacter sulfurreducens和Methanosarcina barkeri的空間分布狀況。生物炭Eh對產(chǎn)甲烷的抑制實驗設計如下：（1）Geobacter sulfurreducens+Methanosarcina barkeri（biochar-free）；（2）Geobacter sulfurreducens+Methanosarcina barkeri+還原劑處理后的生物炭（treated biochar）；（3）Geobacter sulfurreducens+Methanosarcina barkeri+未處理生物炭（untreated biochar）。

1.4 Geobacter sulfurreducens和Methanosarcina barkeri的熒光定量分析

通過熒光定量PCR儀（iQ5TM，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司）對 Geobacter sulfurreducens和Methanosarcina barkeri的數(shù)量進行測定（Summers et al.，2010；Kato et al.，2012a；Tang et al.，2016）。利用16S rRNA基因作為qPCR擴增模板，qPCR反應體系見表1。Geobacter sulfurreducens正向引物序列（Geo494F）為 5’-AGGAAGCACCGGCTAACT CC-3′，反向引物（Geo825R）序列為 5’-TACCCG CRACACCTAGT-3′。Methanosarcina barkeri 定量PCR 正向引物序列（ME1）為 5’-GCMATGCARA THGGWATGTC-3’，反向引物（MCR1R）序列為5’-ARCCADATYTGRTCRTA-3’。Geobacter擴增條件為95 ℃預變性4 min；95 ℃變性20 s，51 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。Methanosarcina擴增條件：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，40個循環(huán)。

表1 Geobacter sulfurreducens和Methanosarcina barkeri定量PCR的擴增反應體系Table 1 Real-time PCR of Geobacter sulfurreducens and Methanosarcina barkeri 16S rRNA gene

2 結果分析

2.1 生物炭的理化特性

兩種生物炭的元素分析及導電特性的檢測結果如表2所示，兩者的碳、氮、氫、氧等元素含量差異不大，但是導電率差異較大，生物炭-1的導電率為 2.4 S·cm-1，有較強的導電性，生物炭-2只有3.4×10-6S·cm-1，幾乎沒有導電性。對兩種生物炭進行紅外光譜分析，結果如圖1所示，兩種生物炭表面官能團在吸收峰3435、1630、1082 cm-1處存在差異，3435 cm-1是-OH基團的吸收峰，代表著酚羥基或醇羥基的存在；1630 cm-1是C=C和C=O雙鍵基團的吸收峰，代表著芳香化程度；1082 cm-1是C-O基團的吸收峰（Uchimiya et al.，2011a，2011b），紅外結果初步表明生物炭-1的羥基、C-O基團和雙鍵基團的含量低于生物炭-2。

2.2 不同導電性生物炭對產(chǎn)甲烷過程的影響

以乙酸為電子供體，向Geobacter sulfurreducens和Methanosarcina barkeri的共培養(yǎng)體系添加不同質(zhì)量濃度（12、25和50 g·L-1）的生物炭-1和生物炭-2。如圖2所示，生物炭的類型及濃度都影響共培養(yǎng)體系的甲烷產(chǎn)生過程，而且不同類型生物炭之間的差異非常明顯。在添加生物炭-1的共培養(yǎng)體系中，與不添加生物炭的對照相比，12 g·L-1生物炭-1抑制了體系前10天的產(chǎn)甲烷活動，25 g·L-1生物炭-1抑制了前15天的產(chǎn)甲烷活動，但在培養(yǎng)后期它們的甲烷產(chǎn)量（約 0.14 mmol）都高于對照（約 0.13 mmol）；50 g·L-1生物炭-1的產(chǎn)甲烷量（約0.11 mmol）則一直低于對照。從產(chǎn)甲烷速率來看（時間-甲烷量曲線的斜率），添加12、25和50 g·L-1生物炭-1體系的產(chǎn)甲烷速率分別在 6（0.015 mmol·d-1）、9（0.016 mmol·d-1）、18（0.017 mmol·d-1）天后開始明顯高于對照處理。與生物炭-1不同，添加不具導電性的生物炭-2對甲烷產(chǎn)量抑制效應明顯，且濃度越高抑制程度越高（圖2b）。由此可見，生物炭的導電性質(zhì)是影響共培養(yǎng)體系產(chǎn)甲烷過程的重要因素。

圖1 生物炭的紅外吸收光譜Fig. 1 Infrared spectra of biochar

采用定量PCR方法，觀察了添加25 g·L-1生物炭-1的共培養(yǎng)體系中的 Methanosarcina barkeri和Geobacter sulfurreducens的生長情況（圖 3）。Methanosarcina barkeri和Geobacter sulfurreducens的起始濃度分別為 5.48±0.22～5.78±0.24×106和3.24±0.15～3.6±0.21×106（單位為基因拷貝數(shù)/反應體系），隨著培養(yǎng)的持續(xù)進行，微生物量不斷增加，表明這兩種微生物都通過代謝活動獲得生長。生物炭-1對Methanosarcina barkeri微生物量的影響與其對甲烷產(chǎn)生量的影響規(guī)律一致；生物炭-1對Geobacter sulfurreducens的生長有促進作用，而生物炭-2對Geobacter sulfurreducens的生長則沒有顯著的影響。這說明在添加生物炭-1的條件下，共培養(yǎng)體系中 Geobacter sulfurreducens參與了代謝活動，這可能是：（1）生物炭的還原過程；（2）與Methanosarcina barkeri互營氧化乙酸產(chǎn)甲烷過程。

已有文獻報道生物炭可被 Geobacter sulfurreducens用作胞外呼吸的電子受體（Yu et al.，2016）。以乙酸為電子供體，生物炭為電子受體，通過Geobacter sulfurreducens菌16S rRNA基因拷貝數(shù)的熒光定量PCR測定反映其生長情況（圖4）。與不添加生物炭的處理相比，添加生物炭處理中的Geobacter sulfurreducens數(shù)量增長并不明顯，培養(yǎng)期間最高基因拷貝數(shù)僅為起始數(shù)量的1.8～2.1倍。但是添加生物炭-1的共培養(yǎng)體系中 Geobacter sulfurreducens數(shù)量增長了近2個數(shù)量級（圖3），這說明生物炭的微生物還原過程并不能完全解釋共培養(yǎng)體系中Geobacter sulfurreducens的生長，這意味著Geobacter sulfurreducens還參與了其他代謝活動，即與Methanosarcina barkeri互營氧化乙酸產(chǎn)甲烷。

圖2 Geobacter sulfurreducens和Methanosarcina barkeri共培養(yǎng)體系添加不同生物炭的甲烷產(chǎn)生量-時間動力曲線Fig. 2 Methane production in the co-culture of Geobacter sulfurreducens and Methanosarcina barkeri supplemented with different concentrations of conductive biochar-1 (a) and non-conductive biochar-2 (b)The error bars represent the standard deviations of the mean of three independent cultures. The same below

圖3 Geobacter sulfurreducens和Methanosarcina barkeri共培養(yǎng)體系（添加和不添加生物炭-1）中Geobacter的基因拷貝數(shù)（a，b）和Methanosarcina的基因拷貝數(shù)（c，d）Fig. 3 The gene copy number of Geobacter in the co-culture of Geobacter sulfurreducens (GS) and Methanosarcina barkeri (MB) with and without 25 g·L-1 biochar-1 (a, b); mcrA gene copy number in the co-culture of Geobactersulfurreducens and Methanosarcina barkeri with and without 25 g·L-1 biochar-1 (c, d)

圖4 生物炭作為電子受體時Geobacter sulfurreducens的生長情況Fig. 4 The gene copy number of pure culture Geobacter sulfurreducens degrading acetate with and without the two types of biochar(The concentration of biochar was 25 g·L-1)

2.3 導電性生物炭促進互營氧化乙酸產(chǎn)甲烷過程

為了進一步驗證共培養(yǎng)體系中 Geobacter sulfurreducens是否參與互營氧化乙酸產(chǎn)甲烷過程，本實驗對比了 Methanosarcina barkeri的單菌體系和Geobacter sulfurreducens+Methanosarcina barkeri共培養(yǎng)體系在添加不同生物炭條件下的產(chǎn)甲烷過程。結果表明（圖5），添加生物炭-1的的單菌體系在培養(yǎng)22 d后的甲烷產(chǎn)量為0.095 mmol，在相同培養(yǎng)時間內(nèi)，添加生物炭-1的共培養(yǎng)體系的甲烷產(chǎn)量達到0.146 mmol；而在添加生物炭-2的條件下，單菌體系和共培養(yǎng)體系的甲烷產(chǎn)量非常接近。通過定量 PCR方法監(jiān)測單菌體系和共培養(yǎng)體系中的Methanosarcina barkeri的生長情況（圖5c和5d），其趨勢符合甲烷產(chǎn)量的規(guī)律。這表明在添加導電生物炭-1體系中，Geobacter sulfurreducens的存在可有效促進產(chǎn)甲烷過程，但在不導電生物炭-2體系中不起作用。由此可推測：（1）Geobacter sulfurreducens參與了產(chǎn)甲烷過程；（2）生物炭的導電性對Geobacter sulfurreducens和Methanosarcina barkeri介導的產(chǎn)甲烷過程至關重要。通過掃描電鏡進一步觀察 Geobacter sulfurreducens與 Methanosarcina barkeri在導電生物炭上的分布情況。Geobacter sulfurreducens的細胞形態(tài)為棒桿狀（Summers et al.，2010），而 Methanosarcina barkeri的細胞形態(tài)為球菌疊堆狀（Liu et al.，2012），二者形態(tài)差異顯著。觀察電鏡圖（圖6）細胞形態(tài)可知，Geobacter sulfurreducens和 Methanosarcina barkeri并沒有直接接觸，但都緊緊吸附于生物炭表面。

圖5 Geobacter sulfurreducens 對甲烷產(chǎn)生量（a，b）和甲烷菌（b，d）的影響Fig. 5 The role of Geobacter sulfurreducens (GS) in methane production by Methanosarcina barkeri (MB) in the presence of 25 g·L-1 conductive biochar-1(a, c) and non-conductive biochar-2 (b, d)

圖6 添加生物炭-1的Geobacter sulfurreducens and Methanosarcina barkeri共培養(yǎng)體系SEM圖Fig. 6 Scanning electron micrography of biochar-amended co-culture of Geobacter sulfurreducens (rods) and Methanosarcina barkeri (spheres)The white arrows denote the representative microbes

2.4 生物炭的Eh對產(chǎn)甲烷的抑制

以上實驗表明，導電性生物炭介導了Geobacter sulfurreducens和 Methanosarcina barkeri之間的直接電子傳遞，從而促進了產(chǎn)甲烷過程。但是，生物炭暫時性抑制共培養(yǎng)體系產(chǎn)甲烷過程（圖 2）的原因不明。生物炭的結構和性質(zhì)相對復雜，含有豐富的官能團，其存在會造成環(huán)境因子的改變。比如，土壤施加生物炭會改變營養(yǎng)元素的生物可利用性、pH值、氧化還原電位（Eh）或電導率（Beesley et al.，2011）。通過監(jiān)測反應體系的 pH和 Eh，我們發(fā)現(xiàn)添加生物炭和未添加生物炭體系的pH值在整個培養(yǎng)期間變化不明顯（6.8～7.2），且都符合產(chǎn)甲烷菌的適宜生長 pH 值（6.5～7.2，Wang et al.，1993）。但是，與不添加生物炭的對照相比（Eh=-60 mV），添加12、25和50 g·L-1生物炭-1后體系的Eh分別升高至60、100和130 mV。

為了驗證添加生物炭改變體系Eh與抑制產(chǎn)甲烷過程的關系，設置了未處理生物炭-1和處理后生物炭-1的兩個共培養(yǎng)體系，即在120培養(yǎng)基添加生物炭 30 d后再接種微生物構建共培養(yǎng)體系。經(jīng)檢測，放置30 d后，添加生物炭-1體系的Eh值降低至-249 mV。主要原因可能是120培養(yǎng)基中含有的還原劑（cysteine和Na2S）與生物炭中具有氧化性的官能團反應，降低了由生物炭造成的培養(yǎng)體系升高的Eh。如圖 7所示，與未添加生物炭-1共培養(yǎng)體系相比，處理后的生物炭-1對整個培養(yǎng)期的產(chǎn)甲烷過程都有明顯促進作用，而未處理生物炭-1體系中前期抑制后期促進的效果與共培養(yǎng)體系一致。在生物炭-2體系中，未添加生物炭體系和處理后生物炭體系的甲烷產(chǎn)量相似，但都明顯高于未處理生物炭體系。這些結果表明，生物炭的高 Eh是抑制產(chǎn)甲烷過程的原因，這也解釋了生物炭濃度越高抑制效應越明顯的規(guī)律。該實驗再次證明了導電性生物炭-1對共培養(yǎng)體系產(chǎn)甲烷過程的促進效應，以及促進效應與生物炭導電性的相關性。

3 討論

由上述實驗結果可知，導電生物炭促進了Geobacter sulfurreducens和Methanosarcina barkeri共培養(yǎng)體系中的乙酸產(chǎn)甲烷過程。Geobacter sulfurreducens和 Methanosarcina barkeri已被證實具備DIET功能：Geobacter sulfurreducens可以通過導電磁鐵礦將氧化乙酸產(chǎn)生的電子傳遞至硝酸鹽還原菌 Thibacillus denitrificans（Kato et al.，2012b）；Methanosarcina barkeri可以直接或通過各種導電介質(zhì)（磁鐵礦、生物炭和活性炭等）從電子供體微生物接收電子還原CO2產(chǎn)生甲烷。Chen et al.（2014b）證明了生物炭可以作為導電介質(zhì)加速 Geobacter metallireducens和Methanosarcina barkeri共培養(yǎng)體系乙醇互營氧化產(chǎn)甲烷過程，Geobacter metallireducens氧化乙醇產(chǎn)生的電子傳遞通過生物炭直接傳遞至Methanosarcina barkeri，從而促進甲烷產(chǎn)生。因此，導電生物炭、Geobacter sulfurreducens和Methanosarcina barkeri滿足構成DIET介導乙酸互營氧化產(chǎn)甲烷體系的基本條件。

本實驗的共培養(yǎng)體系中，Methanosarcina barkeri本身可以利用乙酸單獨完成產(chǎn)甲烷這一代謝過程。因此，Geobacter sulfurreducens是否可以通過氧化乙酸，與Methanosarcina barkeri互營產(chǎn)甲烷，是證明體系中存在DIET介導乙酸互營氧化產(chǎn)甲烷的關鍵。我們以添加了生物炭的培養(yǎng)基分別構建 Methanosarcina barkeri單獨培養(yǎng)體系和Geobactersulfurreducens+Methanosarcina barkeri的共培養(yǎng)體系，通過對比兩種培養(yǎng)體系的產(chǎn)甲烷速率和微生物生長狀況，驗證Geobacter sulfurreducens與Methanosarcina barkeri是否存在互營反應。由實驗結果可知，添加導電生物炭的 Methanosarcina barkeri單獨培養(yǎng)體系的產(chǎn)甲烷速率和甲烷產(chǎn)量都低于添加導電生物炭 Geobacter sulfurreducens+Methanosarcina ta barkeri的共培養(yǎng)體系，且共培養(yǎng)體系中Geobacter sulfurreducens的生物量也有明顯增長。這些結果說明Geobacter sulfurreducens參與了產(chǎn)甲烷過程。

圖7 Geobacter sulfurreducens/Methanosarcina barkeri共培養(yǎng)體系添加處理生物炭-1和未處理生物炭-1的甲烷產(chǎn)生量-時間動力曲線Fig. 7 Methane production in the co-culture of Geobacter sulfurreducens and Methanosarcina barkeri amended with treated biochar and untreated biochar at a concentration of 25 g·L-1. (a) conductive biochar-1; (b) non-conductive biochar-2

已有文獻報道Geobacter sulfurreducens不能與氫營養(yǎng)型的產(chǎn)甲烷菌通過種間氫轉移或種間甲酸轉移進行互營（Cord-Ruwisch et al.，1998；Butler et al.，2009），那就意味著在導電生物炭存在的條件下，Geobacter sulfurreducens和 Methanosarcina barkeri之間存在其他的互營方式。基于生物炭導電性對Geobacter sulfurreducens參與產(chǎn)甲烷過程的必要性，可以推測 Geobacter sulfurreducens和Methanosarcina barkeri之間的互營方式是導電生物炭介導的直接電子傳遞。SEM（圖6）顯示，桿狀Geobacter sulfurreducens 和球菌疊狀的Methanosarcina barkeri并沒有直接接觸，但都緊緊吸附于生物炭表面，說明Geobacter sulfurreducens與 Methanosarcina barkeri之間很可能通過導電生物炭傳遞電子，這一現(xiàn)象與Liu et al.（2012）的研究結果類似。Yu et al.（2015）研究900 ℃燒制的秸稈生物炭對Geobacter sulfurreducens還原降解五氯酚的影響機制時發(fā)現(xiàn)，導電生物炭的類石墨結構區(qū)域的π-π鍵與電子傳遞相關。因此，本實驗中導電生物炭的石墨結構 π-π鍵導電網(wǎng)絡可能介導了Geobacter sulfurreducens與Methanosarcina barkeri之間的電子傳遞，從而加速產(chǎn)甲烷進程。

4 結論與展望

實驗結果表明，導電性生物炭能介導Geobacter sulfurreducens和Methanosarcina barkeri之間的直接電子傳遞，促進乙酸降解產(chǎn)甲烷過程。在水稻土或其他厭氧環(huán)境中，乙酸是有機物厭氧降解過程中最重要的中間產(chǎn)物，耦合電子受體還原過程最終礦化產(chǎn)物為CO2（比如硝酸鹽作為電子受體）或甲烷（CO2作為電子受體）。

本實驗研究結果解釋了Geobacter在產(chǎn)甲烷環(huán)境中利用乙酸產(chǎn)生甲烷的代謝過程，即 Geobacter氧化乙酸產(chǎn)生的電子，通過導電生物炭將電子直接傳遞至產(chǎn)甲烷菌 Methanosarcina還原 CO2產(chǎn)生甲烷，這為揭示Geobacter在產(chǎn)甲烷環(huán)境中的生長提供了科學依據(jù)。將來的研究工作可利用穩(wěn)定同位素13C標記技術表征 Geobacter sulfurreducens和Methanosarcina barkeri共培養(yǎng)體系中乙酸互營氧化途徑，或利用Methanosarcina 突變菌株或抑制劑構建特定甲烷生成途徑研究共培養(yǎng)中的DIET過程。