孫彩霞，潘志彥，戴 芬，鄭蔚然，于國光

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品信息溯源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州310021； 2.浙江工業(yè)大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，浙江 杭州 310032)

浙貝母是著名的中藥材“浙八味”之一，野生浙貝母多生長在林蔭處，現(xiàn)多為栽培。浙貝母主要分布于浙江、江蘇、安徽、湖南等地，浙江的浙貝母產(chǎn)量最大，主要分布于寧波鄞州區(qū)和海曙區(qū)、東陽市、縉云縣、磐安縣、舟山市定海區(qū)等地，其中寧波鄞州區(qū)和海曙區(qū)為浙貝母的原產(chǎn)地。根據(jù)《中國藥典》記載，浙貝母具有清熱化痰止咳，解毒散結(jié)消癰等作用，用于治療風(fēng)熱咳嗽、痰火咳嗽、肺癰、乳癰、瘰疬、瘡毒[1]。

激光拉曼光譜是一種散射光譜，通過與入射光頻率不同的散射光譜進(jìn)行分析以得到分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)方面信息，并應(yīng)用于分子結(jié)構(gòu)研究的一種分析方法[2-3]。拉曼效應(yīng)產(chǎn)生于來自高能量的入射光子與樣品分子振動(dòng)能級(jí)之間的能量交換，產(chǎn)生拉曼位移。拉曼位移的程度對(duì)應(yīng)于分子振動(dòng)能級(jí)的躍遷。在有機(jī)物結(jié)構(gòu)分析中，拉曼光譜適用于對(duì)稱的鍵，如C—C，C=C，C≡C，N—N，S—S等，這些鍵在紅外吸收很弱，但在拉曼散射中很強(qiáng)。拉曼光譜在成分分析中最大的優(yōu)勢(shì)是可以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的無損分析和定量/定性檢測，相對(duì)于現(xiàn)有的光譜、質(zhì)譜、紅外等分析方法，具有無需或者便于前處理，檢測后的產(chǎn)品可以回收利用等優(yōu)勢(shì)。

藥材含有豐富的官能團(tuán)，一方面既與藥材本身豐富的有機(jī)物有關(guān)，另一方面也與藥材的產(chǎn)地有關(guān)。近年來，采用拉曼光譜用于對(duì)中藥材產(chǎn)品的真?zhèn)舞b別和道地性分析比較多見，但用于浙貝母的分析比較少。本研究通過采集浙江省主要浙貝母產(chǎn)地的樣品，進(jìn)行激光拉曼光譜分析，初步建立浙貝母的拉曼光譜圖譜，實(shí)現(xiàn)應(yīng)用拉曼光譜技術(shù)無損、快速、準(zhǔn)確、簡便地鑒別浙貝母的目的，為拉曼光譜在浙貝母等中藥材中的分析應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

浙貝母樣品分別取自寧波市海曙區(qū)章水鎮(zhèn)、東陽市、縉云縣、磐安縣、舟山市定海區(qū)等5個(gè)浙貝母主產(chǎn)區(qū)生產(chǎn)基地。樣品采集時(shí)間為2017年5月份，為浙貝母采收季節(jié)。根據(jù)生產(chǎn)基地面積大小，每個(gè)基地采集1～3個(gè)新鮮樣品，每個(gè)樣品質(zhì)量為500 g，共采集樣品47個(gè)，主要樣品的分布情況見表1。

樣品采用隨機(jī)取樣法采集，采集后的新鮮浙貝母種球用紙巾輕輕擦拭除去泥土后，裝入潔凈的塑料采樣袋中，放入冰箱4 ℃冷藏保存。

1.2 儀器與方法

采用共聚焦拉曼光譜儀(HR800 Lab RAM，Horiba JobinYvon)及配套設(shè)備組成。光譜儀配備531.95 nm激光光源(frequency-doubled Nd∶YAG，20 mW)及CCD(charge coupled device)檢測器(multichannel，air cooled)。光譜測量范圍200～4 000 cm-1，曝光時(shí)間120 s。

選擇表明平整，大小均勻干凈的浙貝母新鮮種球，采用手術(shù)刀切片，選取切片均勻的切片，放置于載玻片上，使其位于激光顯微拉曼光譜儀載物臺(tái)的物鏡視野下，通過微機(jī)屏幕上的影像窗口調(diào)整焦距，測定浙貝母新鮮樣品表面的拉曼光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同產(chǎn)地浙貝母的拉曼光譜

根據(jù)不同產(chǎn)地采集的浙貝母拉曼位移，去除部分樣品差異比較大的樣品，不同產(chǎn)地浙貝母的拉曼光譜位移見圖1。

浙貝母富含糖類及生物堿，由于其不同的產(chǎn)地和品種，形成的產(chǎn)品中微量元素和有效成分含量的差異，形成不同產(chǎn)地浙貝母的拉曼光譜的指紋圖譜。對(duì)比圖1各圖，可以看出，不同產(chǎn)地的浙貝母樣品在475～500、2 800～2 900 cm-1呈現(xiàn)明顯的位移。在800～2 000 cm-1處，不同產(chǎn)地的浙貝母拉曼光譜的位移有所差異。浙貝母可能含有D-葡萄糖、氨基葡萄糖、氘代氨基葡萄糖、氘代N-乙酰基葡萄糖。2 800～2 900 cm-1的位移為—C—H的伸縮震動(dòng)，475～500 cm-1的位移為Si—O鍵的位移和D-葡萄糖。而在2 000～2 800 cm-1，由于熒光干擾，使得這一段的信噪比非常低[4-5]。

2.2 拉曼光譜一階導(dǎo)數(shù)圖譜

根據(jù)2.1節(jié)的分析，5個(gè)不同產(chǎn)地的拉曼光譜在800～2 000 cm-1處，不同產(chǎn)地的浙貝母拉曼光譜的位移差異比較大，因此選擇這一階段的拉曼光譜進(jìn)行一階求導(dǎo)，不同產(chǎn)地浙貝母的一階導(dǎo)數(shù)圖譜見圖2。不同產(chǎn)地的浙貝母出現(xiàn)拉曼特征峰的位置比較相似，在875、912、965、1 153、1 312、1 410、1 482、1 598、1 641 cm-1位移處出現(xiàn)明顯的特征峰，在985、1 025、1 056、1 096、1 112、1 239、1 356、1 378、1 432、1 629、1 692 cm-1位移處出現(xiàn)較為明顯的特征峰。

圖1 寧波市海曙區(qū)(A)、東陽市(B)、縉云縣(C)、磐安縣(D)和舟山市定海區(qū)(E)浙貝母拉曼光譜圖Fig.1 Raman spectroscopic of Thunberg Fritillary Bulb from Haishu District of Ningbo City， Dongyang City， Jinyun County， Pan’an County and Dinghai District of Zhoushan City

圖2 不同產(chǎn)地浙貝母拉曼位移的一階導(dǎo)數(shù)Fig.2 First-order derivative of Raman spectroscopic of Thunberg Fritillary Bulb from different sources

2.3 浙貝母拉曼位移的歸屬

對(duì)比浙江省不同產(chǎn)地和批次的浙貝母的拉曼光譜位移圖譜，以及不同種植區(qū)域浙貝母拉曼位移的一階導(dǎo)數(shù)圖譜，可知浙貝母新鮮種球的拉曼光譜非常穩(wěn)定，在800～2 000 cm-1位移處的特征峰比較豐富。不同產(chǎn)地的浙貝母在475～500、2 000～2 800 cm-1以及875、912、965、1 153、1 312、1 410、1 482、1 598、1 641 cm-1位移處出現(xiàn)明顯的特征峰。查閱文獻(xiàn)初步得知這9處特征峰的歸屬[6-7]。

浙貝母的9個(gè)拉曼位移中，875 cm-1處的位移初步歸屬為甲基C—C鍵振動(dòng)，912 cm-1處的位移初步歸屬為面外C—H變形振動(dòng)，965 cm-1處的位移初步歸屬為環(huán)“呼吸”對(duì)稱伸縮振動(dòng)，1 153 cm-1處的位移初步歸屬為C—C(=O)—C反對(duì)稱伸縮振動(dòng)，1 312 cm-1處的位移初步歸屬為咪唑環(huán)伸縮振動(dòng)，1 410 cm-1處的位移初步歸屬為甲?；h(huán)伸縮，1 482和1 589 cm-1處的位移初步歸屬為C=C伸縮振動(dòng)。通過這些官能團(tuán)振動(dòng)，可判斷出浙貝母內(nèi)所含成分，從而達(dá)到成分分析研究的目的。在不同波長處拉曼光譜的位移強(qiáng)度與所含成分的濃度有關(guān)，這可能由于不同產(chǎn)地的浙貝母生長環(huán)境及品種不同的差異所致，但拉曼光譜用于浙貝母有效成分含量的定量研究還缺乏數(shù)據(jù)支持，可以借助進(jìn)一步的色譜或質(zhì)譜分析進(jìn)行。通過上述分析，可以初步判定浙貝母在800～2 000 cm-1位移處的9個(gè)特征峰作為浙貝母的特征圖譜，作為判定這類產(chǎn)品的信息。

2.4 拉曼光譜在農(nóng)產(chǎn)品無損檢測分析中的應(yīng)用

拉曼光譜用于農(nóng)產(chǎn)品檢測分析，具有免于樣品前處理和無損分析的特點(diǎn)，檢測方法快速、簡便，樣品可以回收利用，在高端農(nóng)產(chǎn)品分析中具有良好的應(yīng)用前景?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，拉曼光譜用于分析棕櫚油、靈芝孢子油等農(nóng)產(chǎn)品是否以次充好、以假亂真方面的研究已有報(bào)道[9-10]。拉曼光譜的特征位移是對(duì)被測物質(zhì)進(jìn)行定性檢測的依據(jù)，由于每種物質(zhì)含有的特征官能團(tuán)對(duì)應(yīng)的拉曼光譜位移缺少豐富的數(shù)據(jù)庫資源，因此拉曼光譜在物質(zhì)的鑒別方面缺少豐富的數(shù)據(jù)庫支持，有待于充分積累特色農(nóng)產(chǎn)品的拉曼光譜信息，作為該類物質(zhì)進(jìn)行拉曼光譜分析的依據(jù)。

3 結(jié)論

拉曼光譜具有無損、快速、準(zhǔn)確、簡便，以及免于前處理和所用樣品易于回收的特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品檢測[8]。拉曼光譜當(dāng)前已成功應(yīng)用于快速鑒別藥材類別、真?zhèn)巍?yōu)劣及產(chǎn)地溯源等方面，但在浙貝母中的應(yīng)用比較少。本研究首次將拉曼光譜用于浙貝母新鮮樣品的檢測，分析了浙江省浙貝母主產(chǎn)區(qū)的拉曼光譜，對(duì)比了同樣產(chǎn)區(qū)不同生產(chǎn)基地和不同生產(chǎn)地區(qū)的浙貝母新鮮樣品拉曼光譜的差異，為拉曼光譜用于浙貝母的檢測分析提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。該方法亦可進(jìn)一步拓展成為鑒別浙貝母真?zhèn)渭爱a(chǎn)地溯源的手段。但需要更多的樣品和分析方法的支持[11-12]。