彭曉東 冼 倩 楊春蘭 龐浩文

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急診科，廣東 湛江 524001)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種氣流受阻且不可逆的慢性炎癥疾病，目前研究發(fā)現(xiàn)炎癥、氧化系統(tǒng)失衡、蛋白酶系統(tǒng)失衡是COPD發(fā)生的可能機(jī)制〔1〕。N-乙酰半胱氨酸(NAC)是一種臨床上廣泛使用的黏液溶解劑，目前可被用來治療COPD，使患者痰黏液癥狀緩解，第1秒用力呼氣量(FEV1)及50%肺活量時(shí)的呼氣流速(MEF50)改善，但主要機(jī)制是通過提高機(jī)體抗氧化能力，降低氧化產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)的〔2～4〕，而對(duì)于NAC是否能夠通過抑制炎癥反應(yīng)來減輕COPD報(bào)道較少，本研究旨在探討NAC對(duì)COPD大鼠炎癥反應(yīng)的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只約4周齡(200±20)g的SD雄性大鼠，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，合格證書：SCXK(滬)2012-0002，大鼠自由飲食和攝水。

1.2主要試劑及儀器 NAC購自美國Sigma公司，批號(hào)p12036；脂多糖(LPS)購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；兔抗核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB p65，p-NF-κB p65，IκBα，p-IκBα及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體購自美國Abcam公司；腫瘤壞死因子(TNF)-α，白細(xì)胞介素(IL)-1β，IL-6，IL-8，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2，MMP-9酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒均購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。ChemiDocTMXRS凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司；ELX800酶標(biāo)分析儀購自美國Bio-Tek公司。

1.3建模及分組 50只大鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，NAC低、中、高劑量組，每組10只。其中模型組及NAC采用煙熏+氣管內(nèi)滴加LPS復(fù)制COPD大鼠模型，具體操作參考相關(guān)文獻(xiàn)〔5〕：兩組大鼠置于已制作好的玻璃煙熏箱內(nèi)，每天2次，每次30 min，每次間隔時(shí)間6 h，連續(xù)28 d，向煙熏箱內(nèi)注入香煙煙霧。同時(shí)在第1、14天麻醉大鼠，沿著氣管一次性緩慢注入200 μg/ml LPS，體積200 μl。正常組照常飼養(yǎng)。每天煙熏前30 min，NAC組分別灌胃給予50、100、200 kg·mg-1·d-1NAC，正常組及模型組給予等量生理鹽水，連續(xù)28 d。

1.4支氣管肺泡灌洗液(BALF)及標(biāo)本的獲得 第28天，用磷酸鹽緩沖液(PBS)灌洗大鼠左肺支氣管肺泡，離心灌洗液并重懸，部分灌洗液用于血細(xì)胞分析儀測量總白細(xì)胞數(shù)，部分灌洗液經(jīng)涂片后，用Kwik-Diff染色法對(duì)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。另外將右肺組織取下并剔除脂肪組織清洗干凈，用于細(xì)胞因子及蛋白的檢測。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色 將右肺組織標(biāo)本固定24 h后，石蠟進(jìn)行包埋，切片后，于二甲苯、梯度酒精、蒸餾水中脫蠟至水洗。蘇木素染色，鹽酸酒精分化，流水沖洗。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固，于鏡下觀察。

1.6ELISA法檢測TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MMP-2及MMP-9含量 取部分右肺組織，勻漿離心后，加入胰蛋白酶裂解，1 500 r/min離心10 min，收集上清液，后取上清液嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.7Western印跡檢測NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取肺組織標(biāo)本，加入細(xì)胞裂解液裂解，離心收集上清液即總蛋白，并測定蛋白濃度。制作5%濃縮膠，12%分離膠，室溫水封靜置30 min。蛋白變性，上樣，進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳，后濕法轉(zhuǎn)膜。一抗溶液(兔抗NF-κB p65，p-NF-κB p65，IκBα，p-IκBα及GAPDH多克隆抗體，稀釋度均為1∶100)孵育，4℃過夜；次日于二抗溶液室溫孵育1 h。于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1NAC對(duì)COPD大鼠肺組織病理形態(tài)的影響 正常組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡清晰完整，無炎性細(xì)胞浸潤；模型組肺泡結(jié)構(gòu)破壞，大量炎性細(xì)胞浸潤；NAC組特別是高劑量組肺泡結(jié)構(gòu)較為完整，炎性細(xì)胞浸潤浸潤較少。見圖1。

圖1 各組肺組織病理形態(tài)(HE，×200)

2.2NAC對(duì)COPD大鼠BALF中各類細(xì)胞數(shù)目的影響 與正常組比較，模型組中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)及白細(xì)胞總數(shù)均顯著提高(P<0.01)；與模型組比較，NAC低、中、高劑量組均顯著下降(P<0.01)。見表1。

表1 各組BALF中各類細(xì)胞數(shù)目比較

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01;下表同

2.3NAC對(duì)COPD大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-8含量的影響 與正常組比較，模型組TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-8含量均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，NAC低、中、高劑量組均顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組肺組織TNF-α，IL-1β，IL-6及IL-8含量比較

2.4NAC對(duì)COPD大鼠肺組織中MMP-2及MMP-9含量的影響 與正常組比較，模型組MMP-2及MMP-9含量均顯著提高(P<0.01)；與模型組比較，NAC低、中、高劑量組均顯著降低(P<0.01)。見表3。

2.5NAC對(duì)COPD大鼠肺組織中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組p-IκBα及p-NF-κB p65表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，NAC低、中、高劑量組p-IκBα表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，NAC中、高劑量組p-NF-κB p65表達(dá)顯著下調(diào)(均P<0.01)。見圖2，表3。

A～E：正常組、模型組、NAC低、中、高劑量組圖2 NAC對(duì)COPD大鼠肺組織中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

組別MMP-2(ng/ml)MMP-9(ng/ml)p-IκBα/IκBαp-NF-κB p65/NF-κB p65正常組0.18±0.020.35±0.030.08±0.010.06±0.00模型組7.53±0.751)8.42±0.841)0.57±0.061)0.38±0.041)NAC低劑量組5.64±0.562)6.13±0.612)0.32±0.032)0.38±0.04NAC中劑量組3.28±0.332)4.72±0.472)0.20±0.022)0.25±0.022)NAC高劑量組1.71±0.172)2.45±0.242)0.11±0.012)0.17±0.022)

3 討 論

NAC是一種含有巰基的半胱氨酸衍生物，能夠通過降解酸性蛋白多肽的二硫鍵，進(jìn)而分解黏蛋白，最終降低痰的黏性，因此被應(yīng)用于各種原因?qū)е碌母螕p傷、肺損傷、重金屬重度、心血管等的治療〔2～4〕。反復(fù)煙熏聯(lián)合2次氣管滴入LPS是目前構(gòu)建COPD大鼠模型最為常用的方法〔5〕，HE染色結(jié)果表明模型大鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，大量炎癥因子浸潤，說明造模成功。本研究結(jié)果表明NAC能顯著改善COPD大鼠肺組織形態(tài)，減少炎癥細(xì)胞浸潤及 BALF中炎性細(xì)胞數(shù)目，提示NAC可能通過抗感染作用抑制COPD大鼠炎癥反應(yīng)。

在COPD過程中單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的TNF-α，IL-1β、IL-6及IL-8加重炎癥反應(yīng)〔6〕。且COPD過程中炎性細(xì)胞釋放大量的MMPs，MMPs降解肺細(xì)胞外基質(zhì)，使細(xì)胞壁變薄，黏液分泌增多，還破壞肺泡結(jié)構(gòu)，使肺泡腔擴(kuò)大，進(jìn)而加重了COPD〔7〕。因此降低炎癥因子水平及MMPs含量能一定程度上緩解COPD。另外NF-κB信號(hào)通路是一類能夠與特異性κB位點(diǎn)結(jié)合的NF，在機(jī)體炎癥反應(yīng)過程中起重要作用〔8〕。生理?xiàng)l件下，NF-κB p65亞基位于細(xì)胞質(zhì)，與IκB位點(diǎn)結(jié)合形成三聚體，不具有轉(zhuǎn)錄活性。在受到LPS等外界信號(hào)刺激時(shí)，IκB位點(diǎn)被降解、磷酸化、三聚體解離，p65進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，而且研究顯示NF-κB在COPD中活性顯著上升，且NAC對(duì)NF-κB p65活性具有抑制作用〔9〕。綜上，NAC能顯著改善COPD大鼠肺組織形態(tài)，減少炎癥細(xì)胞數(shù)目，降低TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MMP-2，MMP-9含量，可能與阻斷NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。