趙德福 寧顯忠

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121000)

目前，針對腦梗死最有效的治療方法就是血管再灌通〔1〕，即缺血再灌注(IR)，但是IR在某種程度上使腦組織損傷進(jìn)一步加重，即腦IR損傷〔2，3〕。IR損傷涉及多種病理過程，其中細(xì)胞外基質(zhì)的破壞扮演重要角色?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9是參與細(xì)胞外基質(zhì)破壞的重要成員〔4〕，其上游調(diào)控基因?yàn)楹艘蜃?NF)-κB。有文獻(xiàn)表明缺血預(yù)處理對腦損傷具有一定的保護(hù)功能〔5〕。但其對腦IR過程中細(xì)胞外基質(zhì)的破壞是否有抑制作用尚不明確。本實(shí)驗(yàn)探討缺血預(yù)處理在腦IR后的細(xì)胞外基質(zhì)破壞過程中是否發(fā)揮保護(hù)所用。

1 資料與方法

1.1一般資料 病理圖像分析儀(德國萊卡公司); 病理組織切片機(jī)(美國AO820)；電子天平(北京賽多利公司)；光學(xué)顯微照相系統(tǒng)(日本佳能公司)。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑(北京博奧森生物技術(shù)公司);NF-κB一抗、MMP-9一抗(武漢博士德生物工程有限公司)。由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的健康SD大鼠60只，雄性，體重230～270 g，許可證號：SCXK(遼)2003-2007。

1.2動(dòng)物分組及模型制備 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(SH)組、IR組及缺血預(yù)處理+IR(IP)組。模型制備參考Longa等〔6〕的方法。所有大鼠術(shù)前6 h禁水，予濃度為3 ml/kg的水合氯醛腹腔注射，固定于手術(shù)臺，于頸中略偏左尋找頸總動(dòng)脈(CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)和頸外動(dòng)脈(ECA)并仔細(xì)分離動(dòng)脈。用手術(shù)線結(jié)扎CCA和ECA的近心端，于大鼠左側(cè)的CCA切一小口，直徑約0.2 mm，將已處理的魚線插入，插入深度為18 mm，以充分阻斷大腦中動(dòng)脈(MCA)的血流供應(yīng)，血流中斷15 min后將魚線深度后撤，使MCA血流再灌注，此為缺血預(yù)處理。以上操作相同，若大鼠MCA血流中斷時(shí)間為2 h，2 h后撤魚線再灌注12 h，此為IR模型。缺血預(yù)處理48 h后，制作IR模型。操作步驟與預(yù)處理模型及IR制作步驟相同，為缺血預(yù)處理+IR模型。假手術(shù)組方法為缺血預(yù)處理基礎(chǔ)上魚線插入時(shí)，其深度不足10 mm，不至于阻斷MCA。所有大鼠于IR 12 h后取腦。

1.3免疫組化法觀察NF-κB、MMP-9的表達(dá) 每組取大鼠10只，用濃度為5 ml/kg的烏拉坦腹腔注射，充分麻醉后斷頭，分離出實(shí)驗(yàn)所需海馬組織，以濃度為4%的多聚甲醛固定，制備切片(約5 μm)，脫蠟，洗滌，3%H2O2處理，磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mol/L)洗滌3次×5 min，滴加一抗(NF-κB兔抗大鼠多克隆抗體或環(huán)氧化酶(COX)-2兔抗大鼠多克隆抗體)，4℃孵育過夜，PBS洗滌5 min×3次，滴加二抗，37℃溫度下孵育時(shí)間為30 min，室溫10 min，PBS洗滌5 min×3次，DAB顯色，應(yīng)用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，酒精梯度脫水，二甲苯分別透明10 min，封片干燥，顯微鏡下鏡下觀察切片。大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞規(guī)則，排列整齊，選擇其為觀察區(qū)域。正常情況下，MMP-9和NF-κB主要存在于胞質(zhì)，表達(dá)量少，被激活后NF-κB從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核。

1.4Western印跡檢測NF-κB、MMP-9蛋白的表達(dá) 標(biāo)本取材為剩余10只大鼠，麻醉，同樣取海馬組織，海馬組織剪碎，加入裂解液，離心分裝，取上清液，制備蛋白樣品；蛋白雜色法測定蛋白含量；10%十二烷基苯硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳；轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；緩沖液封閉雜交；電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒顯色；分析NF-κB和cox-2蛋白表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1神經(jīng)功能學(xué)評分 SH組神經(jīng)功能無障礙；IR組與SH組(0分)比較，神經(jīng)功能障礙明顯，評分〔(2.9±0.3)分〕明顯增加(P<0.01)；IP組與IR組比較，神經(jīng)功能障礙減輕，評分〔(2.1±0.3)分〕明顯降低(P<0.01)。

2.2免疫組化染色結(jié)果 SH組細(xì)胞內(nèi)極少有NF-κB、MMP-9的表達(dá)。與SH組比較，IR組神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)NF-κB及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)MMP-9的表達(dá)明顯增多(P<0.01)。IP組細(xì)胞核內(nèi)NF-κB及胞質(zhì)內(nèi)MMP-9的表達(dá)較IR組明顯減少(P<0.01)。見圖1。

圖1 NF-κB、MMP-9免疫組化染色結(jié)果(×400)

2.3Western印跡法檢測結(jié)果 SH組海馬區(qū)幾乎無NF-κB和MMP-9蛋白表達(dá)。IR組NF-κB和MMP-9蛋白表達(dá)較SH組明顯升高(P<0.01)。IP組NF-κB和MPP-9表達(dá)較IR組明顯降低(P<0.01)。見表1。

表1 各組NF-κB和MMP-9蛋白表達(dá)量

與SH組比較：1)P<0.01；與IR組比較：2)P<0.01

3 討 論

腦IR損傷是缺血性腦血管病的一個(gè)重要病理過程〔7〕。目前認(rèn)為參與IR損傷的機(jī)制有很多，例如細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)〔8〕、細(xì)胞外基質(zhì)破壞等。其中細(xì)胞外基質(zhì)的破壞在腦IR損傷的過程中起到了重要作用。MMP-9是能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的重要物質(zhì)之一，正常腦組織細(xì)胞基本無MMP-9表達(dá)，當(dāng)受到各種不良刺激時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞就可分泌大量MMP-9〔9，10〕，細(xì)胞基底膜被降解，導(dǎo)致腦損傷。NF-κB是MMP-9的上游調(diào)控基因，能調(diào)控MMP-9的表達(dá)。正常情況下NF-κB存在于胞質(zhì)中，不具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄功能〔11〕。在腦組織受損如缺血時(shí)，NF-κB被激活并轉(zhuǎn)入胞核內(nèi)，迅速啟動(dòng)相應(yīng)靶基因轉(zhuǎn)錄，參與炎癥反應(yīng)、自由基損傷等病理生理過程〔12〕，加重腦組織IR損傷。

目前臨床上針對IR損傷的各種外源性治療方法效果均不夠理想，缺血預(yù)處理是指通過某種方式給予短暫的缺血處理后恢復(fù)血流再灌注，以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一種自我保護(hù)機(jī)制，這種機(jī)制可以使機(jī)體在短時(shí)間內(nèi)再次受到缺血缺氧損害時(shí)，使損害在一定程度上有所降低〔13〕。本實(shí)驗(yàn)表明，NF-κB及MMP-9在大鼠腦IR后病理過程中發(fā)揮了重要作用，并且缺血預(yù)處理可以抑制NF-κB及MMP-9在IR后表達(dá)，從而發(fā)揮其腦保護(hù)作用。