孫 超 鄒 婕

(武漢市皮膚病防治院，湖北 武漢 430000)

糖尿病(DM)誘發(fā)的皮膚潰瘍是臨床一大疑難癥，癥狀頑固，遷延不愈，反復(fù)發(fā)作。DM誘發(fā)的皮膚潰瘍病機(jī)與患者激素水平及免疫系統(tǒng)異常有關(guān)〔1〕。中醫(yī)將這類由DM誘發(fā)的皮膚潰瘍歸屬為“瘡瘍”，《靈樞·癰疽》中提到：寒邪客于經(jīng)絡(luò)之中則血泣，血泣則不通，不通則衛(wèi)氣歸之，不得復(fù)反，故癰腫。寒氣化為熱，熱勝則腐肉，肉腐則為膿。即本病難愈與“腐”有關(guān)，因而治療需要以去“腐”生肌為主〔2〕?；仃?yáng)生肌膏是中醫(yī)常用的慢性皮膚潰瘍治療藥方之一，藥方由肉桂、炮姜、黃芪、人參等多味溫陽(yáng)益氣，活血生肌藥物組成，具有較高臨床效果。本研究旨在探究回陽(yáng)生肌膏聯(lián)合重組人表皮生長(zhǎng)因子治療激素與免疫抑制劑致大鼠皮膚潰瘍的實(shí)驗(yàn)效果及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取SPF級(jí)成年雄性SD大鼠72只，平均體重(200±20)g，均購(gòu)自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司，均自由進(jìn)食進(jìn)水，喂養(yǎng)于22～25℃，光照12 h，相對(duì)濕度45%～60%的環(huán)境中。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器與藥品 回陽(yáng)生肌膏由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院制劑中心提供；ATCC25923金黃色葡萄球菌由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院免疫研究生提供；氫化可的松、水合氯醛、檸檬酸、鏈脲佐菌素(STZ)由天津金耀氛基酸有限公司提供。羅氏卓越纖巧型血糖儀及配套試紙購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品有限公司；DH4000AB型電熱恒溫培養(yǎng)箱由天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)；光學(xué)顯微鏡由日本OLYMPUS公司生產(chǎn)。

1.3造模方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、實(shí)驗(yàn)組A和實(shí)驗(yàn)組B各18只。模型組、實(shí)驗(yàn)組A和實(shí)驗(yàn)組B進(jìn)行造模，操作如下：將50 mg/kg STZ注入0.1 mol/L檸檬酸，制成STZ溶液，造模大鼠每只注入10 ml STZ溶液，隨后每天注射10 ml STZ，常規(guī)喂養(yǎng)，3 d后視為大鼠DM造模成功。給予大鼠水合氯醛麻醉，剃除背部毛發(fā)，剪皮至筋膜，將20 mm直徑消毒塑膠環(huán)埋入切口邊緣，縫合，包扎。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 在造模成功后，實(shí)驗(yàn)組A給予回陽(yáng)生肌膏紗條覆蓋創(chuàng)面，實(shí)驗(yàn)組B采用含有回陽(yáng)生肌膏和重組人表皮生長(zhǎng)因子凝膠的紗條覆蓋創(chuàng)面，正常組和模型組均只給予含有凡士林的紗條覆蓋創(chuàng)面，每天換藥1次，給藥15 d。

1.5觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法 觀察各組大鼠用藥前、用藥第4、7、14天的潰瘍面面積及第14天時(shí)創(chuàng)面愈合率=(給藥前創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/給藥前創(chuàng)面面積×100%，對(duì)比治療第3、10天血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β、白細(xì)胞介素(IL)-6；肉芽組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、IL-6水平。血清TGF-β、IL-6采用放射免疫法檢測(cè)，試劑選用北京福瑞生物工程公司提供的相關(guān)試劑盒，操作嚴(yán)格按照相關(guān)說明書進(jìn)行。肉芽組織VEGF、eNOS、IL-6檢測(cè)選用免疫組織化學(xué)方法：常規(guī)包埋、切片、脫蠟，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，選用3%H2O2溶液溫室孵化15 min，洗滌，將切片送入乙二胺四乙酸(EDTA)溶液中修復(fù)10 min，滴入VEGF、TGF、eNOS、IL-6一抗，冷藏，二抗，顯色，復(fù)染，封片，檢測(cè)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組創(chuàng)面愈合比較 用藥前，各組潰瘍創(chuàng)面面積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；用藥第3、7、14天，實(shí)驗(yàn)組A、B潰瘍創(chuàng)面面積均顯著小于模型組(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組B潰瘍創(chuàng)面面積均顯著小于實(shí)驗(yàn)組A(P<0.05)；用藥第14天潰瘍愈合率比較，實(shí)驗(yàn)組B>實(shí)驗(yàn)組A>模型組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1，表1。

用藥14 d圖1 各組用藥3、7、14 d創(chuàng)面愈合情況

組別潰瘍面積(cm2)用藥前用藥3 d用藥7 d用藥14 d第14天潰瘍愈合率(%)正常組-----模型組4.70±0.693.66±0.572.50±0.361.19±0.4474.68±3.57實(shí)驗(yàn)組A4.62±0.803.12±0.431)1.51±0.321)0.58±0.301)87.45±3.291)實(shí)驗(yàn)組B4.68±0.792.69±0.471)2)1.03±0.291)2)0.16±0.091)2)96.58±2.041)2)

與模型組比較：1)P<0.05；與實(shí)驗(yàn)組A比較：2)P<0.05

2.2各組血清TGF-β、IL-6比較 用藥第3、10天，模型組血清TGF-β與正常組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，模型組血清IL-6顯著高于正常組(P<0.05)；用藥第3、10天，實(shí)驗(yàn)組A、B血清TGF-β顯著高于模型組(P<0.05)，血清IL-6顯著低于模型組(P<0.05)；用藥第3、10天，實(shí)驗(yàn)組B血清TGF-β顯著高于實(shí)驗(yàn)組A(P<0.05)，血清IL-6顯著低于實(shí)驗(yàn)組A(P<0.05)。見表2。

表2 各組血清TGF-β、IL-6比較

與模型組比較：1)P<0.05；與實(shí)驗(yàn)組A比較：2)P<0.05；與正常組比較：3)P<0.05；表3同

2.3各組肉芽組織中VEGF、eNOS、IL-6表達(dá)水平比較 用藥第3、10天，模型組肉芽組織中eNOS表達(dá)水平顯著低于正常組(P<0.05)，VEGF、IL-6表達(dá)水平顯著高于正常組(P<0.05)；用藥第3、10天，實(shí)驗(yàn)組A、B肉芽組織中eNOS、VEGF表達(dá)水平顯著高于模型組(P<0.05)，IL-6顯著低于模型組(P<0.05)；用藥第3、10天，實(shí)驗(yàn)組B肉芽組織eNOS、VEGF表達(dá)水平顯著高于實(shí)驗(yàn)組A(P<0.05)，IL-6顯著低于實(shí)驗(yàn)組A(P<0.05)。見表3。

表3 各組肉芽組織中VEGF、eNOS、IL-6表達(dá)水平比較

3 討 論

DM誘發(fā)的皮膚潰瘍其病變區(qū)域皮膚組織在完整性和連續(xù)性損傷之前，就出現(xiàn)組織學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)病變，故臨床認(rèn)為本類皮膚潰瘍屬于內(nèi)源性〔3〕。這種內(nèi)源性病因?qū)е碌钠つw潰瘍又因?yàn)閯?chuàng)傷處相關(guān)生長(zhǎng)因子異常表達(dá)而出現(xiàn)延遲愈合，反復(fù)發(fā)作等情況〔4〕。因而，治療本類皮膚潰瘍的關(guān)鍵在于恢復(fù)創(chuàng)傷處的相關(guān)細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)，維護(hù)病變區(qū)域組織生長(zhǎng)、恢復(fù)相關(guān)調(diào)控機(jī)制的平衡。

中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為DM內(nèi)源性皮膚潰瘍屬于陰證瘡瘍，其病機(jī)為陽(yáng)衰陰虧，治療需以溫陽(yáng)益氣、活血生機(jī)為主〔5〕?！端貑枴り庩?yáng)應(yīng)象大論》中提到：“陰陽(yáng)者，萬(wàn)物之能使也”，“陽(yáng)化氣，陰成形”，認(rèn)為陽(yáng)氣是血肉肌膚生成的關(guān)鍵〔6〕。TGF-β的主要功能表現(xiàn)為促纖維細(xì)胞增殖，促趨化炎癥細(xì)胞聚集，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)合成，促肉芽組織生長(zhǎng)及表皮生成〔7〕。已有研究顯示，外源性TGF-β在誘導(dǎo)上皮細(xì)胞增殖，加速角化運(yùn)動(dòng)，增強(qiáng)角蛋白表達(dá)上具有顯著效果〔8〕。IL-6則是前炎性介質(zhì)的一種，是機(jī)體抗菌炎癥反應(yīng)的重要參與因子，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞增殖具有重要作用。IL-6還可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)而促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞分化、增殖，最終參與創(chuàng)面修復(fù)。本研究提示回陽(yáng)生肌膏聯(lián)合重組人表皮生長(zhǎng)因子治療內(nèi)源性大鼠皮膚潰瘍療效最佳，大鼠創(chuàng)傷區(qū)域相關(guān)生長(zhǎng)、修復(fù)因子明顯高表達(dá)。VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異有絲分裂原，是目前公認(rèn)的最強(qiáng)促血管生成因子。VEGF可通過自分泌和旁分泌方式促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分化、趨化〔9〕。eNOS是存在于內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞中的一種同工酶，具有調(diào)節(jié)血管功能的效果?；仃?yáng)生肌膏由肉桂、炮姜、黃芪、人參、當(dāng)歸等藥組成〔10〕?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸等活血藥物在促VEGF表達(dá)，加速內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分裂、遷移上具有極高療效，可以有效促進(jìn)人體血運(yùn)，防止血管缺血壞死，并且還可以促進(jìn)新生血管生成〔11〕。重組人表皮生長(zhǎng)因子對(duì)機(jī)體多種組織細(xì)胞具有極強(qiáng)的促分裂作用。創(chuàng)面修復(fù)主要通過肉芽填充完成，而肉芽組織則主要由纖維細(xì)胞、新生血管構(gòu)成。因此，加強(qiáng)創(chuàng)面纖維細(xì)胞增殖及新生血管生成是創(chuàng)面治療的根本〔12〕。