張 萍 邢琳琳 阮 昕 寧學(xué)聰 鞏翠珂 王志華 孫武裝

(邢臺市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北 邢臺 054001)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)主要累及肺實質(zhì)、肺血管及氣道〔1〕。目前研究顯示炎癥反應(yīng)是COPD發(fā)生的主要原因之一，炎癥細胞被激活后釋放大量炎癥因子浸潤肺組織、氣道甚至全身機體，進一步參與COPD的發(fā)生發(fā)展〔2〕。血管活性物質(zhì)血管緊張素(Ang)Ⅱ是一種重要的血管及氣道收縮因子，AngⅡ在COPD過程中大量分泌并釋放，導(dǎo)致肺組織進一步損傷〔3〕。有研究表明AngⅡ能活化受體型的酪氨酸激酶，還能夠激活血小板，誘導(dǎo)TXA2表達，促進炎癥因子釋放，對靶組織等造成損傷〔4，5〕，AngⅡ可能對COPD的炎癥反應(yīng)起重要作用。本研究旨在探討AngⅡ在COPD中的作用及相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 50只(200±20)g的SD雄性大鼠，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，合格證書：SCXK(滬)2012-0002，大鼠自由飲食和攝水。

1.2主要試劑及儀器 氯沙坦鉀片，規(guī)格：50 mg，浙江華海藥業(yè)股份有限公司；脂多糖(LPS)購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；兔抗JAK2，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3，p-STAT3及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體均購自美國Abcam公司；白細胞介素(IL)-1β、干擾素(IFN)-γ、IL-4、IL-6、IL-10、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9、MMP抑制劑(TIMP)-1酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒均購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司；ELX800酶標(biāo)分析儀購自美國Bio-Tek公司。

1.3建模及分組〔6〕50只大鼠隨機分為正常組，模型組，氯沙坦低、中、高劑量組，每組10只。其中模型組及氯沙坦組均采用反復(fù)煙熏+氣管內(nèi)兩次滴加LPS復(fù)制COPD大鼠模型：大鼠置于玻璃煙熏箱內(nèi)，每天3次，每次30 min，每次間隔6 h，連續(xù)28 d，向煙熏箱內(nèi)注入香煙煙霧。同時在第1、14天，將大鼠麻醉，沿著氣管一次性緩慢注入200 μg/ml LPS，體積200 μl。而正常組大鼠照常飼養(yǎng)。在每天煙熏前30 min，氯沙坦組大鼠分別給予灌胃5、10、20 mg·kg-1·d-1氯沙坦，正常組及模型組給予等量生理鹽水，連續(xù)28 d。

1.4支氣管肺泡灌洗液(BALF)及標(biāo)本的獲得 第28天麻醉大鼠，將大鼠右支氣管結(jié)扎，用生理鹽水沖洗大鼠左肺支氣管肺泡3次，離心并重懸，灌洗液用于總白細胞數(shù)、中性粒細胞、巨噬細胞及淋巴細胞的計數(shù)。另外取右肺組織并剔除脂肪組織，清洗干凈血跡，用于細胞因子及蛋白的檢測。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色 右肺組織標(biāo)本4%多聚甲醛固定，石蠟包埋并進行切片后，于二甲苯Ⅰ、Ⅱ，梯度酒精，蒸餾水中脫蠟至水洗。蘇木素染色，鹽酸酒精分化，流水沖洗。梯度酒精脫水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明，中性樹脂封固，于鏡下觀察。

1.6ELISA法檢測IL-1β、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10、MMP-9、TIMP-1含量 取部分右肺組織，勻漿離心后，加入胰蛋白酶裂解，1 500 r/min離心10 min，收集上清液，取上清液嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測。

1.7Western印跡檢測JAK/STAT信號通路相關(guān)蛋白表達 取肺組織標(biāo)本，勻漿機勻漿后離心，加入細胞裂解液裂解，4℃離心機離心，收集上清液即總蛋白，并測定蛋白濃度。制作5%濃縮膠，12%分離膠，室溫水封靜置30 min。蛋白變性，取30 ng左右上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳，后濕法轉(zhuǎn)膜。一抗溶液(兔抗JAK2、STAT3、p-STATF3及GAPDH多克隆抗體，稀釋度均為1∶100)孵育，4℃過夜；次日于二抗溶液室溫孵育1 h。于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組肺組織病理形態(tài) 正常組肺組織及支氣管結(jié)構(gòu)完整，未見異常；模型組肺泡斷裂，肺泡間隔變窄，有大量炎性因子浸潤；氯沙坦組肺泡結(jié)構(gòu)較為完整，炎性因子浸潤減少，肺泡間隔變寬。

2.2各組BALF中各類細胞數(shù)目 與正常組比較，模型組中性粒細胞、單核巨噬細胞、淋巴細胞、白細胞總數(shù)均顯著提高(P<0.01)；與模型組比較，氯沙坦低、中、高劑量組均顯著降低(P<0.01)。見表1。

2.3各組肺組織中IL-1β、IFN-γ、IL-4、IL-6及IL-8含量 與正常組比較，模型組IL-1β、IFN-γ及IL-6含量顯著升高，IL-4及IL-10含量顯著降低(均P<0.01)。與模型組比較，氯沙坦低、中、高劑量組中IL-1β、IFN-γ及IL-6含量顯著降低，IL-4及IL-10含量均顯著升高(均P<0.01)。見表2。

2.4各組肺組織MMP-9及TIMP-1含量 與正常組比較，模型組MMP-9含量明顯提高，TIMP-1含量明顯降低(均P<0.01)；與模型組比較，氯沙坦低、中、高劑量組MMP-9含量明顯降低，TIMP-1含量明顯提高(均P<0.01)。見表1。

表1 各組BALF中各類細胞數(shù)及肺組織MMP-9、TIMP-1含量比較

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；下表同

表2 各組肺組織中IL-1β、IFN-γ、IL-4、IL-6及IL-8含量比較

2.5各組肺組織JAK/STAT信號通路指標(biāo)表達 與正常組(0.11±0.01，0.32±0.03)比較，模型組JAK2及p-STAT3表達量(1.12±0.11，0.45±0.04)明顯上調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，氯沙坦中、高劑量組JAK2表達量(0.42±0.04、0.28±0.03)明顯下調(diào)(P<0.01)，低劑量組(1.10±0.18)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而低、中、高劑量組p-STAT3表達量(0.38±0.04、0.27±0.03、0.18±0.02)明顯下調(diào)(均P<0.01)。見圖1。

圖1 各組肺組織JAK/STAT信號通路指標(biāo)表達

3 討 論

研究表明，肺血管收縮反應(yīng)性增強及肺血管重構(gòu)所引起的肺循環(huán)失衡是COPD發(fā)生、發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)，其中COPD所引起的肺血管內(nèi)皮損傷進而導(dǎo)致的血管收縮及舒張之間的失衡是其主要的表現(xiàn)形式〔3〕。AngⅡ是常見的肺血管及氣道收縮因子，COPD或急性肺損傷過程中由于缺血缺氧，酸中毒引起了AngⅡ的大量分泌與釋放，加重了肺損傷〔4，5〕。AngⅡ同時還能誘導(dǎo)中性粒細胞等炎性細胞的聚集，進而調(diào)控黏附因子、趨化因子、細胞因子等多種炎癥介質(zhì)表達，延長組織的損傷時間，參與機體的炎癥反應(yīng)〔4，5〕。AngⅡ主要通過與AngⅡ受體(1型和2型)結(jié)合，發(fā)揮其生物學(xué)調(diào)控作用。因此通過拮抗AngⅡ與AngⅡ受體的結(jié)合，或者降低AngⅡ受體含量均能一定程度上遏制AngⅡ的誘導(dǎo)作用。本研究表明氯沙坦對吸煙引起的COPD小鼠肺損傷具有顯著的保護作用，但是具體作用機制未知〔7〕。另外研究還發(fā)現(xiàn)氯沙坦能夠減輕LPS引起的急性SD大鼠肺損傷，與降低細胞間黏附分子(ICAM)-1表達有關(guān)〔8〕，提示氯沙坦可能對COPD炎癥反應(yīng)具有抑制作用。

吸煙是目前COPD發(fā)生的最為重要的因素之一，煙霧顆?；蛴泻︻w粒致使肺部產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。因此通過反復(fù)的煙熏及氣道滴加LPS成為COPD造模的主要手段，此方法成功率高，且動物肺組織病理變化與人類類似〔6〕。本研究結(jié)果表明氯沙坦能顯著恢復(fù)大鼠肺組織形態(tài)，改善肺泡結(jié)構(gòu)，同時還能降低炎癥細胞浸潤，減少炎癥細胞的分泌；氯沙坦能顯著抑制百草枯急性染毒大鼠肺組織損傷，減輕炎癥細胞浸潤，并增加肺泡間厚度。COPD過程中肺泡灌洗液(BALF)中中性粒細胞、單核巨噬細胞、白細胞、淋巴細胞釋放大量的促炎因子(IL-1β、IFN-γ、IL-6)，而分泌較少的抗炎因子(IL-4、IL-10)。另外炎癥細胞還分泌大量的MMPs(MMP-9)，MMP-9不僅降解了肺細胞外基質(zhì)，使肺細胞壁變薄，還使細胞分泌大量黏液，同時縮短了肺細胞間隙，又促使中性粒細胞、白細胞等炎癥細胞穿過血管向肺細胞進一步的浸潤，加重肺組織炎癥損傷。而正常生理情況下，MMPs與TIMP以1∶1的比例結(jié)合，進而處于動態(tài)平衡，保證細胞外基質(zhì)成分的穩(wěn)定，而在COPD過程中MMP-9大量分泌的同時，TIMP-1的分泌量大大減少。

另外大量的炎癥因子如IL-1β、IL-6等能夠激活多種炎癥信號通路參與機體的炎癥反應(yīng)，如JAK/STAT信號通路。此信號通路是由酪氨酸激酶JAK和轉(zhuǎn)錄因子家族STAT構(gòu)成，當(dāng)JAK受體與酪氨酸激酶受體IL-1β、IL-6結(jié)合形成二聚體后，JAK激酶被活化后，能夠使JAK受體上的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，并與周圍氨基酸序列形態(tài)特定位點，招募含有SH2結(jié)構(gòu)域的STAT蛋白，進而使STAT磷酸化，進入細胞核，促進炎癥因子轉(zhuǎn)錄，加重COPD炎癥反應(yīng)。同時研究還發(fā)現(xiàn)AngⅡ還能激活JAK2/STAT3信號通路，參與高血壓、動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展〔9，10〕，提示氯沙坦可能與JAK2/STAT3信號通路密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明氯沙坦能顯著下調(diào)JAK2及p-STAT3表達。

綜上，AngⅡ受體拮抗劑氯沙坦能顯著改善COPD大鼠肺組織形態(tài)，降低炎癥細胞浸潤，減少炎癥細胞分泌，降低促炎因子IL-1β、IFN-γ、IL-6及MMP-9分泌，提高抗炎因子IL-4、IL-10及TIMP-1分泌，進而抑制COPD炎癥反應(yīng)，此過程可能與阻斷JAK2/STAT3信號通路有關(guān)。