李玉潔 韓倩倩 陳 鑫 徐慧穎 李寒冰 張明昊 趙珍珍

(河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

中藥地黃為玄參科多年生草本植物地黃的新鮮或干燥塊根〔1〕。以地黃為主的復(fù)方如：六味地黃、金匱腎氣丸均為歷代醫(yī)家用于溫補(bǔ)腎陽(yáng)、延緩衰老的代表方劑〔2～9〕。地黃花為地黃的花蕾，有治消渴，腎虛腰痛等功效，《本草綱目》記載：“地黃花研末服用，功同地黃，如腎虛腰脊疼痛，將其研為末，用酒送服”〔10〕。秀麗隱桿線蟲(chóng)(簡(jiǎn)稱(chēng)線蟲(chóng))是存在土壤中的一種低等生物。由于其易于飼養(yǎng)和保存、生長(zhǎng)周期較短、繁殖快、進(jìn)化過(guò)程中高度保守、遺傳信息清晰，與人類(lèi)的同源性基因高達(dá)60%～80%等優(yōu)點(diǎn)，使得線蟲(chóng)成為抗衰老藥物、功能因子研究的理想模型〔11，12〕。本實(shí)驗(yàn)探討地黃花多糖對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1一般材料 菌株與試劑大腸桿菌(Escherichia coli)OP50、野生型秀麗隱桿線蟲(chóng)(C.elegans)為中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院惠贈(zèng)；瓊脂粉及牛肉蛋白胨購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；地黃花采自河南焦作；超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒及考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。實(shí)驗(yàn)儀器：MJX-250B-Z電熱恒溫培養(yǎng)箱上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；SZ51解剖顯微鏡日本奧林巴斯；vd-850超凈工作臺(tái)江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司；MultiskanFC全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2方法 將地黃花粉碎，過(guò)80目篩，稱(chēng)取50 g，置于1 000 ml圓底燒瓶中，石油醚脫脂，濾渣加500 ml水煎煮2次，合并濾液，常溫減壓濃縮干燥，將干燥藥物配制成35%的水溶解，加95%乙醇，使乙醇終濃度為80%，靜置24 h，2 000 r/min離心5 min，下層沉淀物為地黃花粗多糖，干燥后稱(chēng)重，提取率為11.94%。線蟲(chóng)培養(yǎng)采用Brenner〔13〕的方法，將雌雄同體線蟲(chóng)飼養(yǎng)于涂布大腸桿菌OP50(E.coliOP50)的線蟲(chóng)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(NGM)上，20℃倒置培養(yǎng)。線蟲(chóng)壽命測(cè)定于同期化后第4天，挑取大小一致的線蟲(chóng)放入正常或含有3種不同的含藥培養(yǎng)基中培養(yǎng)。分為對(duì)照組、地黃花多糖低、中、高劑量組(25、50、100 mg/L)，以分組當(dāng)天記為線蟲(chóng)生命起始第0天，以取蟲(chóng)器末端輕探蟲(chóng)體無(wú)反應(yīng)記為線蟲(chóng)生命終止，從生命起始到終止時(shí)間記為線蟲(chóng)壽命期。在線蟲(chóng)壽命期內(nèi)，每24 h將各平板上線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至相同的新平板中，記錄各組線蟲(chóng)存活及死亡數(shù)量，依據(jù)線蟲(chóng)生存、死亡的條數(shù)繪制生存曲線。熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)將同期化幼蟲(chóng)置于含或不含藥物的NGM板中，每組3個(gè)板，每板10條，48 h后，將線蟲(chóng)置于35℃培養(yǎng)箱中觀察，每隔1 h記錄線蟲(chóng)死亡、存活數(shù)目，連續(xù)觀察12 h，重復(fù)2次，死亡標(biāo)準(zhǔn)同壽命實(shí)驗(yàn)。氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)將同期化幼蟲(chóng)置于含或不含藥物的NGM板中，每組3個(gè)板，每板10條，48 h后，將各組線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到含有0.4 mmol/L過(guò)氧化氫(H2O2)的NGM培養(yǎng)基板中觀察，每隔1 h記錄線蟲(chóng)存活數(shù)目，連續(xù)觀察12 h，重復(fù)2次，死亡標(biāo)準(zhǔn)同壽命實(shí)驗(yàn)。生殖能力測(cè)定參照Onken等〔11〕的方法，每組挑取10條L4期的線蟲(chóng)到含或不含藥物的NGM板中，每板放置2條線蟲(chóng)。每隔24 h將線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至新板中，直至線蟲(chóng)生殖能力喪失。所有產(chǎn)卵板于20℃倒置培養(yǎng)24 h，記錄幼蟲(chóng)數(shù)量，將每天產(chǎn)生的子代數(shù)目相加即為線蟲(chóng)終身產(chǎn)卵量。SOD活性檢測(cè)將同期化幼蟲(chóng)置于含或不含藥物的NGM板中，每個(gè)平板放入30～35只線蟲(chóng)，每24 h將各平板上線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至相同的新平板中，5 d后收集成蟲(chóng)于EP管中，液氮中反復(fù)凍融3次提取線蟲(chóng)蛋白，離心收集上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行Kaplan-Meier法、One-Way ANOVA分析及LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組線蟲(chóng)壽命比較 與對(duì)照組相比，地黃花多糖低劑量組最大壽命明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，地黃花多糖中劑量組平均壽命及最大壽命均明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，地黃花多糖高劑量平均壽命及最大壽命均無(wú)明顯變化(P>0.05)，見(jiàn)表1。線蟲(chóng)的生存曲線見(jiàn)圖1。

表1 地黃花多糖對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響

與對(duì)照組比較:1)P<0.05

圖1 地黃花多糖對(duì)線蟲(chóng)生存曲線的影響

2.2各組熱應(yīng)激條件下線蟲(chóng)壽命比較 與對(duì)照組〔(7.30±0.29)h〕相比，地黃花多糖低、中、高劑量組平均壽命〔(10.77±0.24)h、(9.12±0.37)h、(8.56±0.39)h〕均顯著延長(zhǎng)(P<0.01)。生存曲線見(jiàn)圖2。

圖2 地黃花多糖對(duì)熱應(yīng)激條件下線蟲(chóng)生存曲線的影響

2.3各組氧化應(yīng)激條件下線蟲(chóng)壽命比較 與對(duì)照組〔(7.05±0.42)h〕相比，地黃花多糖低、中劑量組平均壽命〔(8.74±0.70)h、(9.79±0.44)h〕極顯著延長(zhǎng)(P<0.01)；地黃花多糖高劑量組〔(6.68±0.58)h〕與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。生存曲線見(jiàn)圖3。

圖3 地黃花多糖對(duì)氧化應(yīng)激條件下線蟲(chóng)生存曲線的影響

2.4各組生殖能力比較 與對(duì)照組〔(201.75±6.40)個(gè)〕相比，地黃花多糖低、中、高劑量組平均產(chǎn)卵數(shù)〔(187.53±22.46)個(gè)、(175.50±22.17)個(gè)、(132.83±11.68)個(gè)〕均有下降趨勢(shì)，其中地黃花多糖高劑量組顯著少于對(duì)照組(P<0.01)。

2.5各組SOD活性比較 與對(duì)照組〔(30.29±2.98)mg/L〕相比，地黃花多糖低、中劑量組SOD活性〔(50.96±4.55)、(49.84±1.83)、(23.49±6.22)mg/L〕顯著增強(qiáng)(P<0.05，P<0.01)；地黃花多糖高劑量組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)地黃花多糖低劑量及中劑量均可顯著延長(zhǎng)線蟲(chóng)的壽命，中劑量效果最好，隨著給藥劑量的繼續(xù)增大，作用降低，推測(cè)地黃花多糖抗衰老作用量效曲線呈倒“U”形。線蟲(chóng)壽命的延長(zhǎng)與壓力應(yīng)激狀態(tài)下生存率提高具有很高的相關(guān)性，應(yīng)激能力增強(qiáng)是線蟲(chóng)壽命延長(zhǎng)的原因之一〔14，15〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)地黃花多糖各劑量均可顯著延長(zhǎng)線蟲(chóng)熱應(yīng)激條件下的壽命，提高熱應(yīng)激條件下線蟲(chóng)的存活率。在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中，H2O2能誘導(dǎo)活性氧生成增加，被廣泛用作誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型〔11〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)地黃花多糖低劑量及中劑量對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化有很強(qiáng)的保護(hù)作用，但隨著給藥劑量的繼續(xù)增大，作用效果降低，結(jié)果與壽命實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。壽命與許多生理參數(shù)如：飲食量和生殖能力等密切相關(guān)〔16，17〕。本文結(jié)果推測(cè)，地黃花多糖發(fā)揮抗衰老作用可能與影響生殖能力有一定關(guān)系，但并非主要通過(guò)降低生殖能力發(fā)揮抗衰老作用，有待進(jìn)一步研究。氧化應(yīng)激是指機(jī)體受到刺激后，機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生和消除失衡，活性氧在細(xì)胞內(nèi)蓄積，體內(nèi)活性氧的積聚可造成機(jī)體氧化損傷，氧化損傷被認(rèn)為是導(dǎo)致機(jī)體衰老的一個(gè)重要因素〔18,19〕。SOD作為體內(nèi)主要的抗氧化物酶，在清除自由基方面發(fā)揮關(guān)鍵性作用〔20〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷，地黃花多糖可能是通過(guò)提高線蟲(chóng)體內(nèi)SOD酶活性，進(jìn)而降低體內(nèi)活性氧水平而發(fā)揮抗衰老作用。隨著地黃花多糖用藥劑量的繼續(xù)增大，作用效果減弱，并顯示出一定副作用，據(jù)此推測(cè)地黃花多糖抗衰老作用的量效曲線呈倒“U”形，其抗衰老作用的發(fā)揮，可能與提高線蟲(chóng)體內(nèi)SOD酶活性，增強(qiáng)機(jī)體應(yīng)激能力有關(guān)。