楊柏齡 侯 茜 胡 鋒 張 帆

(甘肅中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院生物教研室 中西醫(yī)結合基礎學科重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

衰老是由內外環(huán)境和遺傳因素等諸多因素相互影響、相互作用而引起的生物學過程，主要表現(xiàn)為連續(xù)性并隨年齡而增的全身性、漸進性、衰退性的形態(tài)變化和功能紊亂〔1〕，對人的生理病理甚至心理都產(chǎn)生著極大的影響。黨參是甘肅道地藥材，也是傳統(tǒng)的補益中藥〔2〕，具有增強記憶能力、學習能力；提高免疫力；抗疲勞、抗氧化等藥理作用〔3〕。目前，未見關于甘肅黨生水煎劑對衰老模型小鼠脾臟組織基因表達影響的研究，本實驗用基因芯片研究甘肅黨參水煎劑對D-半乳糖致衰老模型小鼠脾臟組織基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1動物、藥品及試劑 2月齡SPF級小鼠30只(20±2)g，雄性，昆明種(甘肅中醫(yī)學院實驗動物中心提供)，動物合格證編號：SCXK(甘)2011-0001。素花黨參(產(chǎn)自甘肅文縣，甘肅中醫(yī)學院藥學系晉玲教授鑒定)：制成黨參水煎劑(含生藥濃度為1 g/ml)，置4℃冰箱備用；D-半乳糖購自上海中秦試劑有限公司，批號為20120228。Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，批號為20110602；RNase試劑盒(美國Qiagen公司)，批號為20120125；全基因組表達譜芯片(Agilent小鼠4X44K)、雜交試劑盒、溴乙啶，均購自上?？党缮锕?。

1.2方法

1.2.1分組及造模 將30只昆明種小鼠隨即分為3組：衰老模型組、空白對照組、黨參組，每組10只。于小鼠頸背部皮下注射5%D-半乳糖溶液，1 g·kg-1·d-1〔4〕，空白對照組小鼠每天注射等體積生理鹽水，共42 d。

1.2.2給藥 于造模第11天開始，黨參組灌服黨參水煎劑(15 g·kg-1·d-1)。空白對照組灌服等量生理鹽水，共計42 d。

1.2.3取材 頸椎脫臼處死小鼠，快速分離出脾臟，生理鹽水漂洗后即刻轉入-20℃冰箱冷凍備用。

1.2.4總mRNA的提取 采用Trizol法〔5〕分別提取空白對照組、黨參組及衰老模型組的脾臟細胞總mRNA，并進行純化，確保沒有基因組DNA污染。

1.2.5探針制備 采用Agilent表達譜芯片配套的單色標記芯片基因表達分析方法逆轉錄標記cDNA探針并純化，分別標記各組的總mRNA，并進行等量混合。

1.2.6芯片雜交 將芯片滴上雜交液，放入密閉的雜交盒中，于65℃滾動雜交17 h，用Agilent公司提供的洗液Ⅰ、Ⅱ洗滌，晾干(室溫)，掃描。采用Agilent Scanner G2505B掃描芯片及GeneSpring GX v11.5.1 軟件進行數(shù)據(jù)分析，根據(jù)信號比值(Foldchange)，篩選出表達顯著上調或下調的基因。

1.2.7實時熒光定量PCR驗證基因芯片結果 隨機選擇差異基因進行實時熒光定量PCR驗證基因芯片，選擇的目的基因為：Bcl2、TLR7、IL6RA，管家基因為：GAPDH；引物通過ABIPrimerexPress6.0軟件設計，由上海英駿生物技術有限公司合成；采用實時熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)進行檢測,驗證芯片結果。

2 結 果

2.1脾臟總mRNA的提取結果 各組提取的總mRNA經(jīng)紫外分光光度計分別測定純度，結果都符合D260/OD280 Ratio>1.8，OD260/OD230 Ratio>2(表1)?？瞻讓φ战M、衰老模型組、黨參組小鼠總mRNA的提取質控結果：從OD值分析mRNA甲醛變性凝膠電泳圖(圖1)可以得知，所得的mRNA完整性及純度均較好，沒有明顯降解，符合雜交檢驗的要求。

表1 脾臟總mRNA的質量檢測結果

圖1 各組脾臟mRNA甲醛變性凝膠電泳

2.2雜交結果 雜交芯片經(jīng)掃描儀掃描后獲得芯片掃描圖，圖中的亮點表示高表達的基因，暗點表示低表達的基因，三組同一位置放大的芯片掃描圖，表明芯片的雜交過程是成功的。見圖2。

2.3基因表達差異分析 在包括25 066個探針在內的Agilent小鼠全基因組表達譜芯片上，以Fold Change≥2.0或≤0.5為篩選標準，分別對空白對照組、衰老模型組和黨參組的數(shù)據(jù)進行信號值比對，得到各組上調及下調差異基因的總數(shù)目：衰老模型組與空白對照組比較2 463個(上調982個，下調1 481個)；黨參組與衰老模型組比較1 540個(上調1 126個，下調414個)；黨參組與空白對照組比較666個(上調416個，下調250個)。運用生物信息學方法對衰老模型組與空白對照組、黨參組與空白對照組有顯著表達差異的基因從細胞凋亡及抗細胞凋亡、免疫應答、氧化應激應答這三個方面進行生物學功能分析，并通過黨參組與衰老模型組比較，衰老模型組與空白對照組比較，找出兩組比較中表達有差異的共同基因篩選黨參作用的靶基因，結果顯示：黨參組與衰老模型組比較及衰老模型組與空白對照組比較，表達有差異的共同基因有36個，其中與細胞凋亡相關的基因16個，其中10個上調分別為Bcl2(NM_177410.2)、BIRC5(NM_001012273.1)、RNF7(NM_011279.2)、MKL1(BC050941.1)、PLAGL2(NM_018807.5)、EIF5A(NM_181582.3)、BUB1B(NM_009773.3)、DCC(NM_007831.3)、LGALS7(NM_008496.4)、SQSTM1(NM_011018.2)；6個下調，分別為GZMB(NM_013542.2)、PERP(BC021772.1)、KRT8(NM_031170.2)、SEMA6A(NM_018744.2)、MAP3K5(NM_008580.4)、SPP1(NM_001204233.1)；與免疫應答相關的基因17個，其中10個上調分別為CR2(NM_007758.2)、C1QA(NM_007572.2)、C1QB(NM_009777.2)、H2-DMA(NM_010386.3)、TAP1(NM_013683.2)、H2-Q6(NM_207648.1)、H2-AA(NM_010378.2)、H2-Q10(NM_010391.4)、OAS1B(NM_033541.4)、POU2F2(NM_001163556.1)；7個下調分別IL6RA(NM_133211.3)、IL7(NM_008371.4)、CFH(NM_009888.3)、LY96(NM_016923.2)、TLR7(NM_133211.3)、CFD(NM_013459.2)、CCL11(NM_011330.3)；與氧化應激應答相關的基因3個，均為上調基因分別為GPX1(NM_008160.5)、GPX4(NM_008162.2)、TXNIP(NM_023719.2)；黨參組與空白對照組比較，上述36個基因表達水平?jīng)]有明顯變化。結果表明，這36個基因的表達水平受到黨參用藥的影響。

2.4實時熒光定量PCR驗證基因芯片結果

2.4.1各組基因擴增曲線 從圖3看出，拷貝數(shù)不同的模板隨著擴增循環(huán)數(shù)的增加，逐漸增強其熒光強度，曲線經(jīng)過一段指數(shù)擴增期后趨于平行(出現(xiàn)平臺效應)，模板的拷貝數(shù)和熒光累積值的對應關系在指數(shù)擴增期形成了定量的基礎，各基因擴增曲線都有明顯的指數(shù)擴增期且曲線平滑，說明該檢測具有較好的敏感性。

2.4.2各組基因溶解曲線 圖4橫軸表示溫度，縱軸表示熒光強度，各基因溶解曲線均呈單一峰，且有較銳利的波，其他引物二聚體及非特異性熒光信號未被檢出，說明PCR擴增特異性較好。

空白對照組

衰老模型組

黨參組

圖3 各組基因的擴增曲線

圖4 各組基因的溶解曲線

2.4.3分析結果 各基因擴增曲線平滑且指數(shù)擴增期明顯，說明該檢測敏感性較好。各基因溶解曲線都呈單一峰，說明擴增的產(chǎn)物單一，表明有較好的擴增特異性，檢測重復了3次，循環(huán)閾值(Ct) 由儀器自動讀取，說明方法穩(wěn)定，結果的重復性好，以Ct平均值作為最后的Ct測量結果，用△△Ct相對定量法進行實時熒光定量分析，所測目的基因在3組樣本中的2-△Ct的數(shù)值比較，見表2。黨參用藥后，基因Bcl2表達上調(在衰老模型組表達下調)，IL6RA和TLR7表達下調(在衰老模型組表達上調)，基因芯片的結果與實時熒光定量PCR檢測結果一致，說明基因芯片結果可靠。

表2 衰老模型組、黨參組分別與空白對照組比較 Bcl2、 IL6RA、TLR7的2-△Ct數(shù)值比

3 討 論

延緩衰老和預防老年病在我國人口老齡化日趨顯著的背景下顯得尤為重要，對衰老機制的研究自古有之，中醫(yī)學提出了腎虛學說、脾虛學說等理論，現(xiàn)代醫(yī)學對衰老的機制也提出了免疫學說、氧化自由基學說、凋亡學說等各種理論〔6〕。細胞凋亡是由基因控制的細胞自主的有序死亡，故又稱編程性細胞死亡。本實驗結果顯示，受黨參用藥影響的36個基因中有16個與細胞凋亡相關，如Bcl-2是Bcl-2家族蛋白的重要成員，屬于抑制凋亡亞族成員，位于細胞的核膜、粗面內質網(wǎng)及線粒體膜上，人體內許多組織中如神經(jīng)元都存在著Bcl-2基因的表達，并且許多組織在進行包括細胞凋亡在內的自我更新時也有Bcl-2基因的表達，Bcl-2基因的表達具有抑制細胞凋亡、延長細胞生存期的作用〔7〕。在衰老模型小鼠脾臟中該基因表達顯著下調，而在黨參用藥后，該基因的表達顯著上調，提示甘肅黨參可能通過控制細胞凋亡來延緩機體衰老。

衰老的免疫學說認為免疫系統(tǒng)的中樞器官是胸腺，它的衰退可以使T淋巴細胞減少，整體免疫功能下降，從而導致機體衰老。與機體免疫有關的另一個重要免疫器官是脾臟，脾臟的功能與機體的細胞免疫、體液免疫及非特異性免疫都密切相關；中醫(yī)認為脾為后天之本，氣血生化之源，在人體五臟中占有很重要的地位。本研究結果表明36個在衰老模型組中表達有明顯差異的基因，在空白對照組表達沒有明顯變化，表明這36個基因與衰老相關，其中與免疫應答相關的基因有17個，如IL-6是一種多效能細胞因子，是由單核細胞、巨噬細胞及T淋巴細胞產(chǎn)生，在活化淋巴細胞產(chǎn)生抗體及免疫反應信號傳導等方面起重要作用〔8〕。機體IL-6濃度的異常升高可引起一系列的神經(jīng)內分泌和免疫功能的紊亂，加速衰老進程，是動脈粥樣硬化、老年癡呆等疾病的主要原因〔9〕。本研究中衰老小鼠脾臟組織IL-6基因表達顯著上調，用甘肅黨參水煎劑干預后衰老小鼠脾臟細胞IL-6基因表達顯著下調,揭示了甘肅黨參可能通過調節(jié)免疫應答來延緩機體的衰老。

自由基學說是具有代表性的衰老學說之一，隨著年齡不斷增長,自由基平衡逐漸遭到破壞，過量的自由基受到各種生物大分子過氧化作用攻擊，產(chǎn)生脂質過氧化反應，使蛋白質和核酸分子交聯(lián)，基因突變或DNA復制異常，最終導致細胞的正常功能被嚴重破壞，以至衰老、死亡。本研究結果顯示，受黨參用藥影響的36個基因中有3個與氧化應激相關，如GPX-1，是細胞內谷胱甘肽過氧化物酶1的基因，谷胱甘肽過氧化物酶可利用谷胱甘肽作為還原劑，將機體內過氧化氫或脂質過氧化物轉變?yōu)樗蜉^穩(wěn)定的脂類烴基化合物，阻斷活性氧對機體的損傷〔10〕，從而延緩衰老。本研究結果中，衰老小鼠脾臟細胞中GPX-1基因表達顯著下調，經(jīng)黨參作用后衰老小鼠脾臟細胞GPX-1基因表達顯著上調，揭示了甘肅黨參可能通過調節(jié)氧化應激應答來延緩機體的衰老進程。