劉俊杰 趙宏濤 馮思國 王婧瑤 梁文吉 王一超 李建民 趙雅寧 徐繼偉

(華北理工大學，河北 唐山 063000)

彌漫性腦損傷(DBI)具有較高致死率，主要死因為創(chuàng)傷后廣泛性腦水腫，急性的腦水腫導致腦組織體積增大，顱內(nèi)壓增高，甚至引起腦疝，是急性DBI后致死的主要原因〔1〕。目前臨床主要使用甘露醇行脫水治療來降低顱內(nèi)壓，但有研究報道大劑量應用甘露醇會導致腎衰竭等〔2〕。丁苯酞是我國自行研制的擁有自主知識產(chǎn)權的國家一類新藥，可通過提高腦血管內(nèi)皮一氧化氮(NO)和前列腺素(PG)I2的水平〔3〕，降低細胞內(nèi)鈣濃度、抑制谷氨酸釋放及降低花生四烯酸的含量，抑制氧自由基和提高抗氧化酶活性等機制阻斷急性腦損傷的多個病理環(huán)節(jié)，從而發(fā)揮較強的抗腦缺血作用，丁苯酞聯(lián)合甘露醇對腦損傷的治療國內(nèi)鮮有報道。咬合蛋白是腦微血管緊密連接的主要成分，與腦水腫形成的關系密切〔4〕?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9是一種水解細胞外基質(zhì)的蛋白裂解酶〔5〕，可攻擊腦血管外基膜的層黏蛋白和纖黏蛋白，破壞血腦屏障，也與腦水腫形成密切相關。本實驗觀察丁苯酞與甘露醇聯(lián)合應用對DBI腦水腫及咬合蛋白、MMP-9表達的影響，旨在探討丁苯酞對彌漫性腦損傷大鼠的腦保護機制及丁苯酞與甘露醇合用的效果。

1 材料與方法

1.1材料與分組 清潔級成年雄性SD大鼠240只，平均體重(300±20)g，購自北京維通利華公司〔合格證：SCXK(京)2002-003〕，飼養(yǎng)于河北聯(lián)合大學實驗動物中心，動物自由進食進水。動物房每天光暗交替，相對濕度55%，溫度22℃，常規(guī)飼料喂養(yǎng)。所有動物實驗遵循國際生命指導中心和使用動物實驗原則。按隨機數(shù)字法分為模型組(n=80)，甘露醇組(n=80)，丁苯酞+甘露醇組(n=80)。每組又根據(jù)3 h、12 h、24 h、72 h、144 h分成5個亞組。

1.2DBI模型的建立 參考Marmarou等〔6〕的自由落體打擊大鼠法制作創(chuàng)傷性腦損傷模型：術前12 h大鼠禁食水，乙醚麻醉70～150 s，將麻醉好的大鼠俯臥于固定的海綿床墊(10 cm×20 cm×30 cm)上，用一直徑1.9 cm、質(zhì)量為450 g 的銅制圓柱從1.5 m高度垂直落下撞擊大鼠顱骨冠狀縫與矢狀縫交點處的不銹鋼墊，制造DBI大鼠模型。

1.3給藥方法 甘露醇組和丁苯酞+甘露醇組大鼠腹股溝區(qū)消毒備皮，在嚴格無菌的條件下，在下肢根部作一與腹股溝平行的切口，找到股靜脈。在顯微鏡下以1 ml注射器穿刺股靜脈，造模成功后10 min按1.0 g/kg體重靜注甘露醇。靜注完畢后縫合切口。丁苯酞+甘露醇組在大鼠致傷后10 min 給予丁苯酞軟膠囊植物油溶液(0.1 g/ml) 0.4 ml/kg灌胃，1次/d，直至各時間點處死。模型組及甘露醇組在相同時間內(nèi)給予等量植物油0.4 ml/kg。

1.4腦組織含水量測定 隨機選取3組模型中各時間點大鼠各5只，用10%水合氯醛深度麻醉后，處死取腦，取200 mg左右損傷灶周圍腦組織，應用MA110電子分析天平(上海第二天平儀器廠)稱取腦組織濕重并且記錄后將組織放置于105℃恒溫干燥箱內(nèi)干燥48 h至恒重，稱其干重后按Elliot公式計算腦含水量：腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.5腦血管通透性測定 隨機選取3組模型各時間點大鼠4只，制作伊文思藍標準曲線，據(jù)此測定腦組織的伊文思藍含量(μg/g濕重腦組織)。方法：從尾靜脈以2 ml/kg的量注入2%伊文思藍，2 h后10%水合氯醛麻醉、采用生理鹽水心內(nèi)灌注后斷頭取腦，稱取雙側大腦皮質(zhì)濕重后置于甲酰胺(1 ml/100 g腦組織)中，60℃溫水孵育24 h。1 000 r/min離心機上離心5 min，采用分光光度計(λ=632 nm)測定上清液吸光度(A)值，根據(jù)標準曲線計算出伊文思藍含量。

1.6免疫組織化學檢測腦組織咬合蛋白及MMP-9的表達 隨機選取3組各時間點大鼠各5只，10%水合氯醛深度麻醉后開胸，4%多聚甲醛灌注，斷頭取腦，4%多聚甲醛溶液中4℃冰箱過夜至組織塊沉底，冠狀位切取2 mm組織塊，浸于4%多聚甲醛再固定4 h。切片經(jīng)流水沖洗，脫水透明，石蠟包埋。連續(xù)切片，片厚5 μm。取各大鼠同部位切片3張，脫蠟至水，3%過氧化氫室溫孵育10 min，高壓熱修復，滴加咬合蛋白一抗(1∶100，美國Santa Cruz 生物技術公司)4℃過夜，磷酸鹽緩沖液沖洗，滴加二抗(辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，1∶2 000，武漢博士德生物工程有限公司)，37℃孵育1 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。

1.7Western印跡檢測腦損傷周圍皮層咬合蛋白和MMP-9表達的變化 大鼠處死后，冰上迅速取腦，使用細胞裂解液分別提取各組各時間點大鼠損傷區(qū)周圍腦組織總蛋白，考馬斯亮藍法測定蛋白含量，上樣量為100 μg。15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，硝酸纖維素(NC)轉(zhuǎn)膜，再經(jīng)5%脫脂奶粉封閉; 山羊抗咬合蛋白多克隆一抗(1∶1 000倍稀釋) 、山羊抗MMP-9多克隆一抗(1∶1 000倍稀釋)、山羊抗 actin多克隆一抗(1∶1 000倍稀釋)，4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1∶1 000倍稀釋) 室溫孵育。電化學發(fā)光法(ECL)顯色。采用數(shù)碼成像分析系統(tǒng)軟件進行定量分析。

1.8統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1各組腦組織含水量和伊文思藍含量比較 甘露醇組腦組織含水量較模型組明顯下降(P<0.05)。丁苯酞+甘露醇組腦組織含水量較甘露醇組明顯下降(P<0.05)。其中3 h腦組織含水量開始增加，12 h繼續(xù)增加，24 h達到高峰，72 h腦組織含水量開始下降，144 h腦組織含水量明顯下降。甘露醇組血管通透性較模型組明顯降低(P<0.05)，丁苯酞+甘露醇組血管通透性較甘露醇組明顯降低(P<0.05)。其中3 h血管通透性開始增加，12 h繼續(xù)增加，24 h達到高峰，72 h開始下降，144 h明顯下降。見表1、表2。

表1 各組腦組織含水量比較

與模型組比較：1)P<0.05；與甘露醇組比較：2)P<0.05；與本組前一時間點比較：3)P<0.05，下表同

表2 各組皮質(zhì)區(qū)伊文思藍含量比較

2.2各組腦組織MMP-9免疫組化結果比較 模型組各時間點損傷區(qū)周圍都可見大量被染成棕黃色的陽性細胞，包膜表達，甘露醇組陽性細胞數(shù)在3 h、12 h較模型組有明顯減少(P<0.05)，而在24 h、72 h、144 h無明顯差異(P>0.05);丁苯酞+甘露醇組陽性細胞較甘露醇組明顯減少(P<0.05)。其中傷后3 h MMP-9陽性細胞數(shù)開始加，24 h達高峰，72 h開始減少，144 h明顯減少。見表3。

表3 各組腦組織MMP-9免疫組化結果比較

2.3各組腦組織咬合蛋白免疫組化結果比較 模型組各時間點損傷區(qū)域周圍可見少量被染成棕黃色的陽性細胞，細胞核表達。與模型組相比，甘露醇組大鼠損傷區(qū)周圍陽性細胞數(shù)在傷后3 h明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而在傷后12 h、24 h、72 h、144 h差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與甘露醇組相比，丁苯酞+甘露醇組損傷區(qū)域陽性細胞數(shù)明顯增多(P<0.05)。其中傷后3 h咬合蛋白陽性細胞開始減少，24 h減少最為明顯，72 h開始增加，144 h明顯增加。見表4。

表4 各組腦組織咬合蛋白免疫組化結果比較

2.4各組腦組織MMP-9 Western印跡結果比較 與模型組大鼠相比，甘露醇組在傷后3 h、12 h損傷區(qū)域MMP-9的含量明顯減少(P<0.05)，而在傷后24 h、72 h、144 h無明顯差異(P>0.05)；與甘露醇組相比，丁苯酞+甘露醇組各時間點損傷區(qū)域MMP-9的含量明顯減少(P<0.05)。其中傷后3 h MMP-9含量開始增加，24 h減增加最明顯，72 h開始減少，144 h明顯減少。見表5。

表5 各組腦組織MMP-9 Western印跡結果比較

2.5各組腦組織咬合蛋白Western印跡結果比較 與模型組相比，甘露醇組在傷后3 h損傷區(qū)咬合蛋白含量明顯增多(P<0.05)，其他時相沒有明顯差別(P>0.05)；與甘露醇組相比，丁苯酞+甘露醇組各時間點損傷區(qū)域咬合蛋白含量明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中傷后3 h咬合蛋白含量開始減少，24 h減少最為明顯，72 h開始增加，144 h明顯增加。見表6。

表6 各組腦組織咬合蛋白Western印跡結果比較

3 討 論

腦水腫是顱腦損傷后主要繼發(fā)性病理過程，也是其主要的致死因素。DBI可引起局部腦組織微循環(huán)障礙，缺血缺氧，甚至引起炎癥反應、自由基損傷、血腦屏障通透性增高等病理過程，導致腦水腫形成〔7〕。腦水腫形成后可進一步加重腦組織缺血缺氧，并且可引起顱內(nèi)壓增高，甚至腦疝形成，明顯加重患者癥狀，影響患者預后〔8〕。目前臨床上常用甘露醇等高滲性脫水劑治療腦水腫，其作用機制是①快速擴充血容量，降低血細胞比容和血液黏度，改善血液流變學，增加腦血流量和氧傳遞，使顱內(nèi)壓在幾分鐘內(nèi)降低；②滲透壓效應：通過滲透性脫水作用減少腦組織的含水量；③腦血管作用：在腦血流自動調(diào)節(jié)正常情況下，增加氧輸送可以使局部腦組織中血管收縮；④可能具有清除自由基的作用〔9〕。本研究結果與此一致。Rafols等〔10〕研究結果顯示，腦損傷后12～48 h腦血流減少近三分之一。丁苯酞可通過提高腦血管內(nèi)皮NO和PGI2的水平，降低細胞內(nèi)鈣濃度，抑制谷氨酸釋放，降低花生四烯酸含量，抑制氧自由基和提高抗氧化酶活性等機制阻斷急性腦損傷的多個病理環(huán)節(jié)，具有改善微循環(huán)的作用〔11〕。我們推測，丁苯酞正是通過該機制減輕腦水腫，因此丁苯酞聯(lián)合甘露醇較單純應用甘露醇的效果要好。

MMP-9主要存在于腦組織的海馬、皮質(zhì)和紋狀體中，但正常情況下含量很少〔12〕。本研究結果顯示，傷后3 h損傷區(qū)皮層MMP-9表達開始增加，24 h達到高峰，72 h開始降低，144 h明顯降低，與Lucivero等〔13〕的研究基本一致。甘露醇組在損傷早期較模型組損傷區(qū)周圍皮質(zhì)MMP-9含量有所下降，谷月〔2〕的研究顯示，甘露醇只是高滲性脫水，并未直接影響MMP-9的代謝，脫水的速度可能會對MMP-9的含量產(chǎn)生影響。本文結果提示丁苯酞可減少損傷灶周圍皮層MMP-9的表達。鄢學芬等〔14〕研究表明，丁苯酞具有減少損傷灶周圍中性粒細胞數(shù)目、抑制白細胞介素(IL)-1和腫瘤壞死因子(TNF)-α表達的作用，而中性粒細胞是腦梗死后MMP-9的主要來源，而且MMPs的基因表達受IL-1等細胞因子的調(diào)控。我們推測丁苯酞可通過抑制該炎癥反應過程，從而減少MMP-9的表達。而甘露醇并不能抑制該炎癥反應過程。因此，丁苯酞聯(lián)合甘露醇治療要比單純甘露醇治療MMP-9的表達少。

咬合蛋白是血管內(nèi)皮細胞緊密連接的重要組成部分，DBI患者咬合蛋白的表達明顯減少，因此血管內(nèi)皮細胞的緊密連接破壞，血管內(nèi)皮細胞的通透性增加，腦水腫形成〔15〕。本研究結果顯示，傷后3 h損傷去皮層區(qū)咬合蛋白表達開始減少，24 h達到最低，72 h開始回升，144 h明顯回升。甘露醇組BDI大鼠模型損傷區(qū)域周圍皮層咬合蛋白的含量在傷后3 h較模型組高，其他時相均無統(tǒng)計學差異，其機制尚不明確，國內(nèi)外文獻未見報道。我們推測，咬合蛋白的含量可能也與脫水的速度有關。丁苯酞聯(lián)合甘露醇治療DBI大鼠模型損傷區(qū)域周圍皮層咬合蛋白的含量明顯高于甘露醇治療組。Gidday等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)MMP-9可降解緊密連接中的咬合蛋白，從而破壞血腦屏障的功能，導致腦水腫的發(fā)生。Seth等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)鈣離子濃度可通過調(diào)節(jié)咬合蛋白的絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸的磷酸化狀態(tài)，來調(diào)節(jié)緊密連接的開合，進而影響血腦屏障的通透性。有學者研究〔18〕，顱腦損傷后神經(jīng)細胞和血管內(nèi)皮細胞結構破壞，鈣通道大量開放，鈣離子大量內(nèi)流，進而通過咬合蛋白的調(diào)節(jié)破壞血腦屏障的通透性，加重腦水腫。我們推測丁苯酞可通過降低MMP-9的表達來減少對咬合蛋白的降解，或者通過減少細胞內(nèi)鈣離子的濃度來調(diào)節(jié)咬合蛋白的表達，減少對血腦屏障的破壞，進而減輕腦水腫的程度。因此，丁苯酞聯(lián)合甘露醇組要比單純甘露醇治療腦水腫的程度要輕。