蘭彩蓮 潘曉華 萬 隆 薩喆燕 黃倩茹 朱小香 蔡梅玉 許金森

(福建省中醫(yī)藥研究院 福建省經(jīng)絡感傳重點實驗室，福建 福州 350003)

肥胖癥容易引起糖尿病、心腦血管疾病和脂肪肝等一系列并發(fā)癥，嚴重影響患者生活質(zhì)量。研究〔1〕表明，電針具有較好的調(diào)脂作用，可改善機體代謝狀況，該療法副作用小且經(jīng)濟安全，有效降低血脂，并改善整體功能，患者接受度高。但針刺引起的代謝調(diào)節(jié)的效應規(guī)律和作用機制研究尚存不足，尤其是從脂肪組織細胞因子角度方面。本研究以此為切入點，通過電針干預肥胖模型SD大鼠，觀察并比較電針前后SD大鼠脂肪組織中脂聯(lián)素(ADPN)和瘦素(LP)蛋白含量的變化，初步探討電針對SD大鼠脂肪組織細胞因子的影響，以期為肥胖癥的電針療法提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 ADPN和LP單克隆抗體(英國Abcam公司)。無菌針灸針(華成牌，規(guī)格0.18 mm×13 mm，生產(chǎn)批號：SD13A1105)，SDZ-Ⅱ型電針儀(華佗牌，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，電泳儀(美國Bio-Red公司)，DW-86L626超低溫冰箱(海爾公司)，ALLEGRA 64R高速冷凍離心機(美國貝克曼公司)，回旋式脫色搖床(海門其林貝爾公司)，超靈敏全自動多色熒光、化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國Proteinsimple公司)。

1.2實驗動物 雄性健康SD大鼠40只，體重(150±10)g ，動物許可證號：SCXK(閩)2016-0002(福建醫(yī)科大學實驗動物中心)。適應性喂養(yǎng)1 w后，飼養(yǎng)于本院動物房(普通級)，控制室內(nèi)溫度為25～28℃，相對濕度為50%～70%。本次實驗全程中，動物飼養(yǎng)條件依據(jù)《實驗動物管理條例》(國家科學技術委員會頒布)。動物處置方法依據(jù)《關于善待實驗動物的指導性意見》(2006年科技部發(fā)布)。

1.3飼料配制 高脂飼料配方：普通飼料 67%、豬油 5%、麻油1%、奶粉 5%、蔗糖 5%、雞蛋 10%、花生 5%、食鹽 2%〔2〕，委托北京華阜康生物科技股份有限公司合成。

1.4動物分組和模型建立 造模前隨機分為兩組，高脂飲食組給予高脂飼料飲食，另一組給予正常飲食。電針前高脂飲食組和正常飲食組分別按照隨機數(shù)字法分組，前者分為肥胖對照組和肥胖電針組，后者分為正常對照組和正常電針組，每組10只，控制環(huán)境溫度濕度，自由飲水。飼養(yǎng)8 w以上，以高脂飲食組體重增長值超過正常飲食組10%且Lee指數(shù)差異有統(tǒng)計學意義作為判斷造模成功的標準。

1.5電針干預 肥胖電針組和正常電針組在造模結(jié)束后開始電針干預，穴位選擇足三里穴(位于膝關節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約5 mm處，在脛腓骨間隙中)和內(nèi)庭穴(第2、3跖骨結(jié)合部前方凹陷處)〔3〕。無菌針灸針常規(guī)消毒，針刺得氣后，接華佗牌電針儀，電針參數(shù)：疏密波，頻率1.5檔(15 Hz)，強度約0.5檔(0.5～1 V)，以SD大鼠后肢輕微顫動且不掙扎為度。1次/d，連續(xù)電針30 d；其余兩組每天同一時期同法束縛，不施加電針干預，1次/d，連續(xù)30 d。

1.7實驗指標測定

1.7.1SD大鼠脂肪組織樣品收集 電針療程結(jié)束次日斷頭處死SD大鼠，迅速解剖分離腹腔脂肪組織，切取脂肪組織約0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm大小，置于離心管中，存放于-80℃冰箱備測。

1.7.2脂肪組織ADPN和LP蛋白含量測定 取1 g脂肪組織，加入0.5 ml組織裂解液勻漿；10 000 r/min離心10 min，取上清；在上清中加入3倍體積的上樣緩沖液煮沸5 min；離心10 min，用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)進行蛋白檢測。取15 μl蛋白上樣進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，用4%積層膠、10%分離膠電泳。將膜放入牛血清白蛋白(BSA)封閉液室溫封閉1 h，合吐溫-20的Tris緩沖液(TBST)洗膜3次，每次5 min；加入大鼠ADPN、LP單克隆抗體1∶1 000稀釋，4℃孵育過夜，TBST搖床蕩洗3次，每次5 min。加入二抗及抗生物素抗體〔辣根過氧化物酶(HRP)標記〕，室溫孵育膜1 h。TBST洗膜3次，每次5 min。加入發(fā)光劑顯色2 min，曝光膠片，顯影定影掃描記錄(冰上進行)。用化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)分析目標帶的分子量和凈吸光度值，與內(nèi)參抗體β-actin吸光度值相比，比值為檢測蛋白的相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1造模前后SD大鼠體重和體重增長值比較 高脂飲食組與正常飲食組造模前體重差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；造模8 w后，20只高脂飲食大鼠中，淘汰體重增加不明顯的2只(造模失敗)，20只正常飲食組中，淘汰2只體重異常增加過多的大鼠(不合格對照)，故高脂飲食組與正常飲食組各18只納入后續(xù)實驗及統(tǒng)計。結(jié)果顯示高脂飲食組體重增長值平均比正常飲食組多約10%，高脂飲食組造模后體重、體重增長值及Lee指數(shù)與正常飲食組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，顯示肥胖模型復制成功。見表1。

2.2各組大鼠脂肪組織ADPN和LP蛋白表達量的比較 肥胖電針組脂肪組織ADPN蛋白表達量(0.74±0.26)明顯上升，LP蛋白表達量(0.77±1.56)明顯下降，與肥胖對照組(0.50±0.17，1.73±0.73)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。但對于正常飲食組，電針干預后，正常電針組(0.47±0.29，0.66±0.38)和正常對照組(0.46±0.22，0.75±0.16)ADPN和LP蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

表1 造模前后SD大鼠體重、體重增長值及Lee指數(shù)比較

與正常飲食組相比：1)P<0.05

3 討 論

ADPN是脂肪細胞分泌的一種細胞因子，參與了體內(nèi)的糖脂和內(nèi)分泌代謝，可能機制為借助激活特定信號途徑，如過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)-γ、PPAR-α和腺嘌呤核糖核苷酸依賴的蛋白激酶(AMPK)等，通過抑制肝糖原異生、促進肝臟脂肪酸氧化、促進骨骼肌脂肪酸氧化及刺激攝入葡萄糖和分泌胰島素等反饋提高機體胰島素敏感性〔4〕。目前關于ADPN相關信號通路的具體研究較少，特別是從中醫(yī)角度,筆者推測針刺效應改變能量代謝的作用機制中包含ADPN參與的一系列信號轉(zhuǎn)導過程的實現(xiàn)。

LP是一種能量平衡調(diào)節(jié)激素，可作為反映高脂血癥病程的一個指標。LP主要通過抑制食物攝入和調(diào)節(jié)體內(nèi)能量代謝起作用〔5,6〕。LP基因廣泛表達于各種脂肪組織，并以皮下表達量為最高〔7〕。研究證實LP能通過下丘腦特定基因抑制蛋白的合成和分泌，降低食欲，增加能耗，從而起到調(diào)節(jié)能量代謝和調(diào)脂的作用〔8〕。劉志誠等〔9〕對大鼠檢測認為針灸調(diào)整改善了體內(nèi)血清的LP水平。肥胖患者大多數(shù)血清LP水平高于正常值，即存在LP抵抗〔10～12〕。綜合上述學者研究，LP抵抗反饋影響體內(nèi)的物質(zhì)和能量代謝，通過不同途徑或機制導致了肥胖等多種疾病的發(fā)生發(fā)展。因此筆者認為在肥胖的臨床治療中可針對LP抵抗采取干預措施，有望成為改善肥胖癥狀的切入點。

針灸作為一種綠色，經(jīng)濟，副作用小的自然療法，大眾可接受性高，對肥胖癥有一定改善作用，筆者推測針刺通過調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等體內(nèi)代謝過程發(fā)揮作用，在此過程中，LP抵抗及其他脂肪細胞因子可能發(fā)揮重要作用，影響一系列能量和物質(zhì)轉(zhuǎn)換機制，其間的聯(lián)系值得深入探索。楊春壯等〔13，14〕研究推測肥胖者LP過多分泌的改善可能是針刺減肥作用機制之一。但針刺效應究竟是作用于肥大的脂肪細胞使體脂量下降而導致LP、胰島素抵抗水平的變化，還是機體對LP敏感性提高、興奮交感神經(jīng)系統(tǒng)，促進脂肪組織的分解、產(chǎn)熱增加而發(fā)揮降脂作用，抑或是影響了更復雜的脂肪-胰島內(nèi)分泌軸的功能活動，或者通過下丘腦激活AMPK通路發(fā)揮作用，這一切還有待深入研究〔15〕。

傳統(tǒng)中醫(yī)學認為肥胖與胃經(jīng)有著非常密切的聯(lián)系，脾胃為氣血生化之源，胃強脾弱是肥胖的發(fā)病基礎，肥胖癥初發(fā)病時或青少年型肥胖大多數(shù)為胃腸實熱型。綜合傳統(tǒng)中醫(yī)理論、既往的動物實驗研究和臨床實踐經(jīng)驗來看，胃經(jīng)可能通過抑制中樞食欲，增加機體產(chǎn)熱及抑制血脂和體脂合成等方面對機體代謝改變產(chǎn)生影響。本研究取穴為足三里和內(nèi)庭，均屬足陽明胃經(jīng)，能夠清瀉胃熱，抑制食欲亢奮，可達到減肥降脂之功效。另有研究表明胃經(jīng)足三里和內(nèi)庭相配伍可調(diào)整肥胖機體內(nèi)分泌紊亂及能量代謝過程，抑制食欲亢進的狀態(tài)，使失調(diào)紊亂的生理生化過程獲得調(diào)整，從而使體內(nèi)物質(zhì)代謝與能量代謝向正常水平轉(zhuǎn)化〔10〕。

本研究結(jié)果顯示針刺明顯增加了肥胖SD大鼠脂肪組織中的ADPN表達水平，并大幅度地抑制了LP蛋白的表達，改善了肥胖大鼠體內(nèi)的LP抵抗狀態(tài)，對脂肪組織中的蛋白代謝具有良性改善作用，提示電針足三里和內(nèi)庭穴可能通過上述蛋白影響體內(nèi)一系列代謝過程。同樣的電針療程作用于正常飲食大鼠，ADPN和LP蛋白表達變化不顯著，顯示電針對正常大鼠體內(nèi)代謝影響不大。本實驗結(jié)果可為解釋經(jīng)絡物質(zhì)基礎和機體能量代謝方面提供一定的實驗資料。鑒于本次樣本量較少，電針療程較短，該療效是否具有普遍性還有待增大樣本量及療程深入研究。課題組進一步的研究方向?qū)⒓性谥炯毎蜃有盘栟D(zhuǎn)導、能量代謝失衡的發(fā)生機制(包括中樞和外周及其相互關系)和針刺效應影響因素方面，為肥胖及相關疾病的針灸防治提供一個新的理論支撐。