楊時(shí)煌 羅育豪 翁雪芬 彭裕輝 許鎰洧

(汕頭市龍湖區(qū)第二人民醫(yī)院急診科，廣東 汕頭 51500)

近年來(lái)歐美國(guó)家乳腺癌的死亡率逐年下降，其中早期篩查和早期診斷發(fā)揮了重要作用〔1〕。早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌，可顯著提高患者生存率，并且增加患者保乳治療率。尋找乳腺癌早期診斷血清/血漿分子標(biāo)志物，無(wú)疑將有助于早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌。近10年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體標(biāo)志物有望成為腫瘤早期診斷血清分子標(biāo)志物〔2～4〕。本研究分析乳腺癌患者、乳腺良性腫瘤患者和正常對(duì)照者p53自身抗體的血清水平，探討血清p53自身抗體與乳腺癌的相關(guān)性及診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1臨床資料 于2012年10月至2013年6月，在汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院乳腺中心收集乳腺癌患者125例和乳腺良性腫瘤患者33例。所有患者均為治療前患者，并經(jīng)過(guò)活組織病理學(xué)檢查確診。125例乳腺癌患者均為女性，年齡40～72歲，中位年齡51歲。33例乳腺良性腫瘤患者均為女性，年齡31～68歲，中位年齡46歲。正常對(duì)照組為116例年齡與乳腺癌患者匹配的女性體檢者，并被證實(shí)無(wú)任何腫瘤相關(guān)疾患，年齡41～70歲，中位年齡50歲。所有標(biāo)本均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，患者均知情并同意。所有的受試者均在早晨空腹行靜脈采血，采集3 ml，靜置30 min后離心(3 500 r/min)10 min，分離得到的血清在低溫冰箱-80℃保存。

1.2儀器和檢測(cè)試劑 酶標(biāo)儀(賽默飛公司品牌)，酶標(biāo)板(96孔，江蘇海門浩天生物器材廠)，人p53重組蛋白和兔抗p53多克隆抗體(舟山同生生物科技公司)，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗人IgG或羊抗兔IgG(美國(guó)Santa Cruz公司)，3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB，廈門英科新創(chuàng)公司)。

1.3p53自身抗體的檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清中p53自身抗體。用磷酸鹽緩沖液(PBS)將人p53重組蛋白稀釋到0.1 μg/ml，包被于酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜。棄去酶標(biāo)板孔內(nèi)液體，采用自制含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBST)對(duì)酶標(biāo)板洗板3次。酶標(biāo)板各孔加入封閉液200 μl(1%牛血清白蛋白+PBST)，孵育1 h(37℃)，洗板。加入100 μl受試者血清樣品(1∶110稀釋)和質(zhì)控樣品(50例乳腺癌患者的血清混合制成)，封閉液作為陰性對(duì)照，兔抗p53多克隆抗體作為陽(yáng)性對(duì)照，所有檢測(cè)均做兩平行孔，并與溫箱孵育1 h(37℃)，洗板；加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)羊抗人IgG或羊抗兔IgG(均為1∶10 000稀釋)，孵育1 h(37℃)，洗板5次；最后，每孔加入顯色液100 μl(TMB-過(guò)氧化氫)，顯色15 min(37℃避光)；加入終止液50 μl，酶標(biāo)儀在測(cè)定波長(zhǎng)為450 nm、校正波長(zhǎng)為630 nm時(shí)檢測(cè)各樣品的A值(即A450 nm/A630 nm)。判斷臨界值(Cutoff值)：116例正常對(duì)照組血清p53自身抗體檢測(cè)OD值的均數(shù)加上2倍標(biāo)準(zhǔn)差(sd)，陽(yáng)性為≥臨界值，陰性<臨界值。

2 結(jié) 果

2.1血清p53自身抗體在乳腺癌、乳腺良性腫瘤患者和正常對(duì)照組中的水平 血清p53自身抗體的平均滴度水平在乳腺癌組、乳腺良性腫瘤組和正常對(duì)照組中分別為0.159±0.252、0.060±0.053和0.045±0.037。與正常對(duì)照組相比，血清p53自身抗體的平均滴度水平比乳腺癌組和乳腺良性腫瘤組均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。進(jìn)一步分析顯示，在乳腺癌組，血清p53自身抗體的平均滴度水平比乳腺良性腫瘤組升高，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

2.2p53自身抗體檢測(cè)乳腺癌的診斷價(jià)值 ROC曲線分析顯示(圖2)，p53自身抗體區(qū)分乳腺癌和正常對(duì)照組的AUC值為0.715(95%置信區(qū)間：0.652～0.779)，區(qū)分乳腺癌和乳腺良性腫瘤患者的AUC值為0.625(95%置信區(qū)間：0.527～0.724)。根據(jù)Cutoff值的判斷標(biāo)準(zhǔn)，p53自身抗體對(duì)乳腺癌的診斷Cutoff值為0.119。此時(shí)，檢測(cè)p53自身抗體區(qū)分乳腺癌患者和正常對(duì)照組的敏感度為32.8%，特異度為95.7%；區(qū)分乳腺癌和乳腺良性腫瘤患者的敏感度為32.8%，特異度為87.9%。

圖1 p53自身抗體在各組血清中的水平

圖2 血清p53自身抗體區(qū)分乳腺癌和正常對(duì)照組(A)及乳腺癌和乳腺良性腫瘤(B)的ROC曲線圖

3 討 論

乳腺癌患者5 年生存率與腫瘤分期密切相關(guān)。張敏璐等〔4〕的研究表明，早期乳腺癌5年生存率為98.3%，中期乳腺癌為83.5%，伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者僅為23.3%。由此可見(jiàn)，早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌對(duì)提高患者總體生存率意義重大。目前，臨床上常用的乳腺癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物，如癌胚抗原(CEA)、糖鏈抗原(CA)153等，在晚期乳腺癌具有較高的敏感性，但這些標(biāo)志物的陽(yáng)性率在早期乳腺癌中并不高。近年來(lái)研究證實(shí)，在不同類型的腫瘤患者，無(wú)論早期或晚期，對(duì)比正常人群，均可檢測(cè)到血清針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體水平提高〔5〕，提示自身抗體檢測(cè)在惡性腫瘤血清學(xué)早期診斷方面的潛在應(yīng)用前景。在乳腺癌方面，有研究表明自身抗體可以在乳腺癌發(fā)病前5年的無(wú)癥狀階段被檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果〔6〕。Dyachenko等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照者相比，Zuotin相關(guān)因子(ZRF)自身抗體和R序列包含蛋白(KRR)1自身抗體在早期乳腺癌患者血清中的水平均顯著升高。這些研究提示，腫瘤自身抗體在乳腺癌患者血清中是存在的，有潛力作為一種有效的乳腺癌早期診斷方法。

p53基因是一種抑癌基因，是細(xì)胞生長(zhǎng)重要的負(fù)調(diào)節(jié)因子。p53的功能與腫瘤發(fā)生發(fā)展、細(xì)胞凋亡等關(guān)系密切。人類腫瘤中，p53突變是最常見(jiàn)的基因突變，50%以上的腫瘤會(huì)出現(xiàn)該基因突變。研究提示，腫瘤自身抗體的產(chǎn)生與腫瘤相關(guān)抗原的突變、過(guò)表達(dá)和翻譯后修飾等密切相關(guān)〔8～10〕。血清p53自身抗體在絕大多數(shù)惡性腫瘤患者(如食管癌、肝癌、結(jié)直腸癌等)中水平升高〔11，12〕。在乳腺癌方面，Liu等〔13〕發(fā)現(xiàn)p53自身抗體在102例乳腺癌患者和146例正常對(duì)照者中的診斷敏感性為24.5%，特異度為90.0%；其中，在早期乳腺癌患者，其診斷敏感度為22.8%。Yang等〔14〕的研究證實(shí)，p53自身抗體對(duì)乳腺癌的診斷敏感度為31%，特異度為100%。本研究表明p53自身抗體不僅可以區(qū)分乳腺癌患者和正常對(duì)照者，而且有助于區(qū)分良惡性乳腺腫瘤。

綜上所述，本研究提示p53自身抗體與乳腺癌患者存在相關(guān)性，具有一定的診斷價(jià)值。然而，p53自身抗體對(duì)乳腺癌的診斷敏感度較低，即使血清p53自身抗體檢測(cè)能最終用于對(duì)乳腺癌患者的早期發(fā)現(xiàn)，也必須聯(lián)合其他自身抗體等分子標(biāo)志物，進(jìn)一步提高診斷敏感度，并通過(guò)大樣本、多中心研究進(jìn)行驗(yàn)證。