刁菁，李樂，王曉璐，樊英，于曉清，許拉，蓋春蕾，王勇強，葉海斌

(1.山東省海洋生物研究院，山東 青島 266104； 2. 山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室，山東 青島 266104； 3. 日照市萬澤豐漁業(yè)有限公司，山東 日照 250000)

虹鱒Oncorhynchusmykiss為鮭科Salmonidae、大麻哈魚屬Oncorhynchus的冷水性魚類，具有生長快、肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)全面等特點，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織向世界各國推廣的優(yōu)質(zhì)養(yǎng)殖品種之一。中國自1959年開始養(yǎng)殖虹鱒，目前，養(yǎng)殖范圍已擴大到20多個省、自治區(qū)和直轄市，發(fā)展十分迅速，隨著虹鱒養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，加之養(yǎng)殖戶對水質(zhì)綜合調(diào)控的重視程度不夠，養(yǎng)殖環(huán)境條件日趨惡化，各種病害問題接踵而至，嚴(yán)重影響了虹鱒養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

癤瘡病(Funmculosis)是鮭鱒養(yǎng)殖過程中常見細菌病之一，鮭鱒癤瘡病可分為急性型、亞急性型、慢性Ⅰ型和慢性Ⅱ型，虹鱒患此病時多表現(xiàn)為慢性型或亞急性型[1]，患病魚通常表現(xiàn)為體色發(fā)黑、食欲不振、鰭基部充血、皮膚潰瘍等癥狀。癤瘡病的病原為殺鮭氣單胞菌Aeromonassalmonicida，該菌屬氣單胞菌科Aeromonadaceae、氣單胞菌屬Aeromonas[2]，是一種不能運動、兼性厭氧的革蘭氏陰性菌，其最適生長溫度為22～25 ℃，35 ℃以上不生長。該菌地理分布、宿主范圍廣泛，除鮭科魚類以外，還能夠感染鯉Cyprinuscarpio、河鱸Percafluviatilis、六線魚Hexagrammosotakii、大菱鲆Scophthalmusmaximus、大西洋鱈Gadusmorhua、裸蓋魚Anoplopomafimbria等[3]。目前，國內(nèi)學(xué)界對殺鮭氣單胞菌的研究主要集中在殺鮭氣單胞菌的分離鑒定、致病性、生長模型、藥敏特性等方面[4-6]，隨著大西洋鮭Salmosalar養(yǎng)殖的興起，對于殺鮭氣單胞菌與宿主間的作用機理和免疫防病基

礎(chǔ)理論的研究也逐步開展[7-8]。

2016年6月，山東濰坊某虹鱒養(yǎng)殖場暴發(fā)了一起虹鱒皮膚潰瘍病，主要外觀癥狀表現(xiàn)為體色發(fā)黑、體表潰爛，鰭基部充血發(fā)紅，少數(shù)肛門紅腫突出，腸道充血、出血，腎臟腫大。本研究中，從患病魚病灶處分離獲得1株優(yōu)勢菌株，利用常規(guī)生理生化和分子生物學(xué)方法進行了菌種鑒定，驗證了其致病性，并檢測分析了其胞外產(chǎn)物特性以及毒力基因的攜帶情況，旨在為殺鮭氣單胞菌的鑒定及其致病機理研究提供參考，并為虹鱒殺鮭氣單胞菌病的防控積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

患病虹鱒取自濰坊某虹鱒養(yǎng)殖場，體質(zhì)量為(160±5)g，體長為(26±2)cm。健康虹鱒取自山東省日照市萬澤豐漁業(yè)有限公司，體質(zhì)量為(105±5)g，體長為(20±2)cm。

細菌培養(yǎng)基胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(Tryptic Soy Agar，TSA)和血平板均購自青島海博生物有限公司，癤瘡病培養(yǎng)基(Furunculosis Agar，F(xiàn)A)購自英國Microgen公司；生理生化鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司，細菌快速鑒定板購自美國Biolog公司,細菌DNA提取和PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司;其他化學(xué)試劑和引物均購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離 取癥狀典型的瀕死病魚，無菌條件下從體表肌肉潰瘍處、腎臟、腸道等病灶處挑取部分組織，劃線于TSA平板上，28 ℃下培養(yǎng)24 h，挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢菌落進行純化培養(yǎng)，直至獲得純培養(yǎng)菌，并將培養(yǎng)菌置于超低溫冰箱(-80 ℃)中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細菌鑒定

(1)形態(tài)學(xué)觀察。將分離獲得的純培養(yǎng)菌接種于TSA平板和FA平板上，于28 ℃下培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)和色素產(chǎn)生；挑取處于活躍生長期的單菌落涂片，酒精燈上干燥固定后，進行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡油鏡下觀察；同時，取少量菌落, 用25 g/L磷鎢酸負染，在透射電鏡下觀察細菌形態(tài)。

(2)常規(guī)生理生化鑒定。無菌操作挑取適量菌接種于生理生化鑒定管中，于28 ℃下培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。測定的生理生化指標(biāo)包括氧化酶、精氨酸、賴氨酸、七葉靈、硫化氫、吲哚、V-P試驗、甘露醇、肌醇、水楊苷、葡萄糖產(chǎn)氣、阿拉伯糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、β-半乳糖苷酶、NaCl濃度和動力試驗等。

(3)Biolog GENⅢ鑒定板。按照說明書要求，將調(diào)整好濃度的菌液接種于Biolog GENⅢ鑒定板，于28 ℃下培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。

(4)16S rDNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。挑取單一菌落懸浮于無菌去離子水中，100 ℃下水浴5 min，冷卻后在4 ℃條件下以10 000 r/min離心10 min，上清液即為PCR擴增反應(yīng)的模板。用于16S rDNA基因PCR擴增的引物為通用引物27F和1492R。PCR反應(yīng)體系(共50 μL)：Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye)25 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各2 μL，模板1 μL，ddH2O 20 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃下預(yù)變性4 min；94 ℃下循環(huán)變性30 s，55 ℃下退火復(fù)性30 s，72 ℃下延伸60 s，共進行30個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸6 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳確定特異條帶后，直接交由上海生物工程技術(shù)股份有限公司進行PCR產(chǎn)物的純化和序列測定。參考陸夢瑩等[9]的方法，將測得的序列通過Blast檢索和ClustalX 1.8軟件比對分析，采用Mega 2.1鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自舉分析進行置信度檢測，自舉數(shù)集1000次。

1.2.3 人工感染試驗

(1)接種菌液的制備。試驗菌株于28 ℃下培養(yǎng)24 h后，用0.9%無菌生理鹽水洗脫，共洗2次，然后以6000 r/min離心10 min，將沉淀重懸后，細菌濃度為1.5×109CFU/mL，10倍系列稀釋菌懸液至濃度為1.5×108、1.5×107、1.5×106CFU/mL。

(2)回歸感染。試驗用健康虹鱒每組10尾，按不同菌懸液濃度分為4個試驗組，并設(shè)生理鹽水對照組，每組設(shè)3個重復(fù)。養(yǎng)殖水溫為(17±1)℃，全天充氣，每天換水50%。暫養(yǎng)7 d后，給試驗組每尾魚腹腔注射0.1 mL不同濃度的菌懸液，給對照組每尾魚注射同體積的0.9%無菌生理鹽水。定時觀察記錄，取瀕死魚的病灶及內(nèi)臟器官進行細菌再分離和鑒定。按改進的寇氏法計算該菌株的半致死濃度。

1.2.4 菌株RBWF-1毒力基因檢測 采用TaKaRa試劑盒方法提取細菌基因組DNA。參照Reith 等[10]對殺鮭氣單胞菌基因組信息中毒力基因的分析，根據(jù)GenBank上登錄的相應(yīng)基因序列，分別設(shè)計并合成擴增氣溶素(aer)、溶血素(hly)、封閉帶毒素(zot)、DNA酶(dna)、絲氨酸蛋白酶(ser)、磷脂酶(lip)和S層蛋白(sp)共7種毒力基因的引物，利用PCR檢測分離株RBWF-1的毒力基因攜帶情況，引物序列、擴增基因片段預(yù)計大小和退火溫度見表1。PCR反應(yīng)體系(共20 μL)：Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye)10 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各1 μL，模板1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下變性1 min，55～59 ℃下復(fù)性1 min，72 ℃下延伸1.5 min，共進行30個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min。用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增結(jié)果，擴增產(chǎn)物由上海生物工程技術(shù)股份有限公司進行TA克隆和測序。

表1 毒力基因檢測引物、退火溫度和目的產(chǎn)物大小Tab.1 Primer sequences, annealing temperature and product sizes of virulence genes

1.2.5 胞外產(chǎn)物(ECP)活性分析 利用平板玻璃紙法制備ECP。將菌株RBWF-1劃線接種于預(yù)先鋪好無菌玻璃紙的TSA平板上，于28 ℃下培養(yǎng)24 h，然后用無菌生理鹽水清洗菌體，4 ℃條件下以6000 r/min離心20 min，收集上清液，用0.22 μmol/L微孔濾膜過濾后，置于冷凍干燥機內(nèi)凍干，收集凍干粉末并用適量生理鹽水重懸，利用BSA法測定蛋白濃度，用生理鹽水調(diào)整到濃度為1 mg/mL備用。

參考賀揚等[11]的方法分別制備脫脂奶平板(5%脫脂奶粉)、兔血平板(5%脫纖維兔血)、淀粉平板(0.2%可溶性淀粉)、尿素平板(2%尿素及0.2%酚紅)、吐溫80(1%吐溫80)平板和DNA平板(0.2%DNA及0.01%甲苯胺藍)，采用牛津杯法將制備的ECP分別接種于以上平板，每孔200 μL，于28 ℃下培養(yǎng)24 h 后，觀察透明圈產(chǎn)生情況，判斷ECP中蛋白酶、溶血素、淀粉酶、脲酶、脂酶和DNA酶產(chǎn)生情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離鑒定

2.1.1 病原菌的分離和形態(tài)學(xué)觀察 從瀕死病魚的病灶處，分離獲得1株形態(tài)、大小一致的優(yōu)勢菌，命名為RBWF-1，其在TSA平板上生長菌落形態(tài)為圓形、灰白色，且濕潤、細小、邊緣光滑，直徑約為2 mm；在含0.1%考馬斯亮藍的TSA上為深藍色菌落；在FA平板上培養(yǎng)48 h以上不產(chǎn)生棕色色素；革蘭氏染色鑒定為短桿狀、兩端鈍圓、革蘭氏陰性菌(圖1-A)；掃描電鏡下觀察，細菌呈短桿狀，有的成對或多個成串，無鞭毛，菌體周圍生有許多細小的菌毛(圖1-B)。

2.1.2 菌株RBWF-1的生理生化特性 常規(guī)生理生化測定結(jié)果顯示：分離菌株RBWF-1呈氧化酶陽性；能利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露醇、七葉靈、精氨酸和賴氨酸，不能利用肌醇和N-乙酰葡萄糖胺；發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；吲哚、V-P試驗、ONPG試驗陽性；不產(chǎn)硫化氫； 加入0、10、30 g/L NaCl菌株生長，加入60、80、100 g/L NaCl菌株不生長，無動力。根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊(第九版)》[12]及《魚類及其他水生動物細菌實用鑒定指南》[12]，各項指標(biāo)經(jīng)對比，與殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種Aeromonassalmonicidasubsp.masoucida相近(表2)。

表2 菌株RBWF-1的生理生化特征

注：+為陽性;-為陰性

Note：+, positive；-, negative

利用Biolog自動微生物鑒定系統(tǒng)測定結(jié)果顯示:菌株可利用的唯一碳源有糊精、甘油、明膠、L-天門冬氨酸、L-谷氨酸、L-組氨酸、D-葡萄糖酸和甲酸；當(dāng)pH為5及加入40 g/L以上的NaCl時，菌株不生長；菌株對1%乳酸鈉、林可霉素、萬古霉素、萘啶酸、亞利福霉素、亞碲酸鉀不敏感，對鹽酸胍、丁酸鈉、溴酸鈉敏感。系統(tǒng)鑒定該菌株為殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種Aeromonassalmonicidasubsp.masoucida，相似度(SIM)為0.516，位距(DIST)為7.223。

2.1.3 16S rDNA基因序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 擴增獲得菌株RBWF-1的16S rDNA基因序列長度為1445 bp，測序后通過NCBI上Blast進行同源性檢索，發(fā)現(xiàn)其與殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種標(biāo)準(zhǔn)菌株NBRC 13748及殺鮭氣單胞菌無色亞種標(biāo)準(zhǔn)菌株NCIMB 1110的16S rDNA基因序列同源性最高，一致性均為99.6%。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，菌株RBWF-1與殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種、殺日本鮭亞種、無色亞種和史氏亞種聚為一個分支(圖2)。結(jié)合生理生化各項分類指標(biāo)測定結(jié)果，將菌株RBWF-1鑒定為殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種。

2.2 人工感染試驗

將不同濃度的菌液腹腔注射到健康虹鱒體內(nèi)，在感染2 d后，注射菌液濃度為1.5×109CFU/mL和1.5×108CFU/mL的魚開始出現(xiàn)死亡，感染7 d后死亡率達到100%(表3)。被感染魚體腹鰭基部充血發(fā)紅、肛門突出、肌肉出血、腸道出血，與原始發(fā)病魚體癥狀一致(圖3)，而對照組未表現(xiàn)出任何癥狀。從人工感染發(fā)病瀕死虹鱒的腎臟處重新分離菌株，其形態(tài)和生理生化鑒定結(jié)果與菌株RBWF-1一致，因此，認為分離菌株RBWF-1是虹鱒皮膚潰瘍病的致病菌。根據(jù)寇氏法測定其半數(shù)致死濃度(LD50),其計算公式為

lg(LD50)=Xk-d(∑Pi-0.5)。

其中：Xk為最大劑量對數(shù)；d為相鄰兩組劑量對數(shù)之差數(shù)；Pi為死亡率，i為組號。經(jīng)計算：

lg(LD50)=lg(1.5×109)-1×(1+1+0.633+

0.3-0.5)=6.743,

LD50=5.5×106CFU/mL。

這表明，RBWF-1為較強毒力的菌株。

2.3 菌株RBWF-1 毒力基因的 PCR檢測

依據(jù)GenBank上登錄的殺鮭氣單胞菌主要毒力基因序列，設(shè)計并合成了擴增aer、hly、zot、dna、ser、lip和sp7種毒力基因的引物，以提取的菌株RBWF-1基因組DNA為模板，進行PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，RBWF-1中攜帶以上7種毒力基因，產(chǎn)物大小分別為654、1866、1093、950、1280、1254、1503 bp，除了sp產(chǎn)物片段與預(yù)期目的片段大小相差6個堿基外，其他產(chǎn)物片段均與目的基因片段大小一致(圖4)。將TA克隆測序獲得的序列通過Blast比對，發(fā)現(xiàn)這7種毒力基因與殺鮭氣單胞菌(菌株S68、S121和A449)序列一致性為99%～100%。

注：A為革蘭氏染色照片；B為掃描電鏡照片Note: A, gram staining micrograph; B, scanning electron micrography圖1 菌株RBWF-1形態(tài)觀察Fig.1 Morphological observation of strain RBWF-1

圖2 基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Aeromonas species based on 16S rDNA sequences

注：A為外觀癥狀；B為內(nèi)臟器官癥狀Note：A，exterior symptoms；B，symptoms of visceral organs圖3 虹鱒感染殺鮭氣單胞菌菌株RBWF-1后的外觀及內(nèi)臟器官癥狀Fig.3 Symptoms of exterior and visceral organs of rainbow trout Oncorhynchus mykiss infected with Aeromonas salmonicida strain RBWF-1

注：M為DL2000 DNA Market；1為氣溶素基因；2為溶血素基因；3為封閉帶毒素基因；4為DNA酶基因；5為絲氨酸蛋白酶基因；6為磷脂酶基因；7為S層蛋白基因Note:M,DL2000 DNA Marker; 1,aer gene; 2,hly gene; 3,zot gene; 4, dna gene; 5,ser gene;6,lip gene;7,sp gene圖4 殺鮭氣單胞菌菌株RBWF-1毒力基因PCR檢測結(jié)果Fig.4 PCR amplification of virulence genes in Aeromonas salmonicida strain RBWF-1

表3 人工感染試驗結(jié)果

2.4 胞外產(chǎn)物(ECP)活性分析

利用牛津杯法測定菌株RBWF-1胞外產(chǎn)物酶活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脫脂奶平板、DNA平板和吐溫80平板上牛津杯周圍形成透明圈，淀粉平板滴加Lugol氏碘液后牛津杯周圍顏色未變紫色，兔血平板出現(xiàn)β-溶血環(huán)，尿素平板未變色，說明ECP中檢出蛋白酶、溶血素、淀粉酶、脂酶和DNA酶，未檢出脲酶(表4)。

表4 殺鮭氣單胞菌菌株RBWF-1毒力基因及胞外產(chǎn)物檢測結(jié)果

注：+為陽性；-為陰性

Note：+， positive；-， negative

3 討論

3.1 致病性殺鮭氣單胞菌的分離鑒定

殺鮭氣單胞菌是一種嗜冷無動力的氣單胞菌，廣泛分布于海淡水中，曾給世界主要鮭鱒養(yǎng)殖區(qū)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，目前,仍是鮭鱒養(yǎng)殖過程中需重點防控的病原之一。伯杰氏細菌鑒定手冊中將殺鮭氣單胞菌分為5個亞種：殺鮭亞種A.salmonicidasubsp.salmonicida、無色亞種A.salmonicidasubsp.achromogenes、殺日本鮭亞種A.salmonicidasubsp.masoucida、史氏亞種A.salmonicidasubsp.smithia和溶果膠亞種A.salmonicidasubsp.pectinolytica[12]。根據(jù)其形態(tài)學(xué)和生理生化特征，如褐色色素產(chǎn)生、溶血性、蔗糖發(fā)酵、菌落大小等，將殺鮭亞種稱為典型株(typical)，其他亞種及不符合5種亞種特征的菌株均歸為非典型株(atypical)[13]。與殺鮭亞種主要引起鮭科魚類典型的癤瘡病不同，非典型株宿主范圍更廣，發(fā)病癥狀也以皮膚潰瘍或非典型疥瘡為主[14]。本研究中從患皮膚潰瘍病的虹鱒體內(nèi)分離獲得1株優(yōu)勢菌RBWF-1，通過人工感染試驗發(fā)現(xiàn)，該菌株能引起魚體體色發(fā)黑、體表潰爛、鰭條發(fā)紅、腸道充血等癥狀，與原始病魚癥狀相同。該菌株形態(tài)學(xué)、生理生化、動力鑒定結(jié)果顯示，其與殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種最接近，但不發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣、不產(chǎn)硫化氫，這與伯杰氏手冊中參考菌株存在差異，分析可能是由于菌株宿主來源、生長環(huán)境、菌株自身變異等不同因素造成。BiologGenIII微孔板可對細菌進行94種表型測試，其中包括71種碳源利用測試以及23種化學(xué)敏感性測試。細菌在測試板上所顯示出的“表型指紋”被用來在種水平上鑒定該微生物。本研究中利用Biolog微孔板對分離菌鑒定的結(jié)果與生理生化鑒定結(jié)果一致，說明該微孔板可用于殺鮭氣單胞菌各個亞種間的鑒定。另外，本研究中通過16S rDNA基因序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建發(fā)現(xiàn)，菌株RBWF-1與殺鮭氣單胞菌的16S rDNA基因序列同源性最高，其在系統(tǒng)發(fā)育樹中與殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種、無色亞種和史氏亞種聚為一個分支，且與殺日本鮭亞種和無色亞種進化距離最接近。由此可見，16S rDNA序列在殺鮭氣單胞菌中高度保守，適用于種的鑒定，但是對于亞種的鑒別，只能作為參考，還必須結(jié)合生理生化各項分類指標(biāo)測定結(jié)果判定。隨著殺鮭氣單胞菌宿主范圍的擴大，目前已報道的殺鮭氣單胞菌,特別是非典型株生化特征呈現(xiàn)出較高的多樣性，但其中與公認的5個亞種完全吻合的較少[15]，隨著分類學(xué)的進一步發(fā)展，該問題會得到解決和補充完善。

3.2 殺鮭氣單胞菌毒力因子的檢測

細菌毒力因子是決定其致病力的重要因素之一。殺鮭氣單胞菌的毒力因子按照功能可分為7大類，包括外毒素、胞外酶、黏附因子、分泌系統(tǒng)、Fe攝取系統(tǒng)、抗藥基因和群體效應(yīng)[10]。其中，氣溶素(aerolysin)[16]、溶血素(hemolysin)[17]、蛋白酶(protease)[18]、表面陣列蛋白(surface layer)[19]、菌毛(pilus)[20]、Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)[21]、Fe載體(siderophore)[22]和群體效應(yīng)激活受體[23]等為已報道的殺鮭氣單胞菌主要毒力因子。本研究中從毒力基因和胞外產(chǎn)物特性兩個方面研究了殺鮭氣單胞菌RBWF-1的毒力因子，并選取7種主要毒力基因aer、hly、zot、dna、ser、lip和sp進行PCR檢測，均成功擴增并經(jīng)測序驗證，同時，收集胞外產(chǎn)物進行了溶血性及蛋白酶、脂酶、核酸酶、淀粉酶和脲酶的體外活性測定，除脲酶活性未檢出外，其他均為陽性結(jié)果。其中，溶血素、蛋白酶、脂酶、核酸酶在基因和蛋白水平的檢測結(jié)果一致，說明胞外產(chǎn)物的生物活性可能與菌株攜帶的毒力基因相關(guān)，同時也暗示了分離菌株RBWF-1具有較強的致病力。

研究表明，氣單胞菌的致病性并非由單一毒力因子所完成，而是由多種毒力因子共同作用，且毒力基因的種類及數(shù)量在不同菌株間存在差異。毒力因子的種類不同導(dǎo)致不同菌株間致病力的差異[24-26]。王一娟[27]通過毒力基因型的比較發(fā)現(xiàn)，在未發(fā)病池塘菌株中多以單獨的毒力基因存在為主，分析這可能就是環(huán)境菌株不能致病的原因之一。本研究中所檢測的毒力因子中，氣溶素和溶血素是氣單胞菌重要的毒力因子，氣溶素兼有溶血性、腸毒性和細胞毒性，可用于初步判定氣單胞菌的致病性[28]；蛋白酶、脂酶、核酸酶、淀粉酶、封閉帶毒素和S層蛋白，在細菌黏附、侵染、增殖以及毒素分泌、釋放過程中發(fā)揮著重要作用，能夠增強氣單胞菌的毒性[10,29]；通過體外感染發(fā)現(xiàn)，菌株RBWF-1的致病力較強，分析可能與其含有多種毒力因子有關(guān)。

開展對細菌毒力因子的研究,對于細菌檢測及免疫防控技術(shù)的建立具有十分重要的意義。首先，將細菌保守的毒力基因作為特異性檢測的靶基因，可以建立相應(yīng)的分子生物學(xué)快速檢測方法。Kong等[30]以氣溶素基因aero、侵襲性質(zhì)?？乖璈基因ipaH、侵襲性質(zhì)?？乖瑽基因ipaB、黏附侵襲位點基因ail、腸毒素胞外分泌蛋白基因epsM及16S-23S rDNA 間隔區(qū)Vpara為檢測靶基因，建立了包括嗜水氣單胞菌在內(nèi)的6種常見病原菌的多重PCR檢測方法，進一步提高了病原檢測效率與準(zhǔn)確性；Gustafson等[31]和劉帥等[32]分別依據(jù)編碼殺鮭氣單胞菌表面陣列蛋白基因vapA和Fe載受體基因fstA，建立了殺鮭氣單胞菌PCR和實時熒光定量PCR檢測方法。其次，細菌毒力因子是研制細菌亞單位疫苗和減毒疫苗的重要依據(jù)。氣單胞菌的基因工程亞單位疫苗一直是研究的熱點并積累了豐碩的研究成果，主要集中在對外毒素、外膜蛋白等毒力因子的重組表達技術(shù)及其作為候選疫苗組分在抗感染免疫中發(fā)揮的免疫保護作用研究[33-35]，例如Marana等[36]根據(jù)殺鮭氣單胞菌菌株A449基因組信息，從潛在保護性抗原中篩選出RTX 蛋白、鐵載體、菌毛蛋白、鞭毛蛋白、丁質(zhì)酶、膠原酶等14種蛋白進行體外重組表達，研制出3種亞單位疫苗，通過體內(nèi)攻毒試驗和體外ELISA方法研究了3種亞單位疫苗的免疫保護作用，并對各組分所發(fā)揮的作用進行了分析。另外，以不同毒力基因缺失突變體為基礎(chǔ)研制出的細菌減毒疫苗也顯示了較強的免疫保護力，為細菌疫苗的研制提供了數(shù)據(jù)和參考[37-40]。因此，開展細菌毒力因子研究，對于探明細菌致病機理，建立有效防控技術(shù)意義重大。

綜上所述，本研究中利用微生物學(xué)和分子生物學(xué)方法，對患皮膚潰瘍病的虹鱒進行了病原菌的分離和鑒定，并對其致病性及毒力因子進行了檢測分析，研究結(jié)果可為中國虹鱒養(yǎng)殖過程中殺鮭氣單胞菌的感染特征、分類鑒定及疫苗研制提供數(shù)據(jù)和參考依據(jù)。