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        北沙參多糖的提取工藝、理化性質(zhì)及生物活性研究

        2018-08-01 07:43:20景永帥蘇蕾韓鈺張丹參張瑞娟吳蘭芳鄭玉光秦
        食品與機械 2018年6期
        關(guān)鍵詞:工藝

        景永帥蘇 蕾韓 鈺張丹參張瑞娟吳蘭芳鄭玉光秦 璇

        (1. 河北科技大學化學與制藥工程學院,河北 石家莊 050018;2. 河北中醫(yī)學院藥學院,河北 石家莊 050200;3. 石家莊市第二醫(yī)院康復國際部,河北 石家莊 050062)

        北沙參為藥用植物珊瑚菜(GlehnialittoralisFr. schmidt ex Miq.)的根,被《本草綱目》列為五參之一,是衛(wèi)生部公布的藥食兩用資源,具有清補肺陰、和中降逆、涵養(yǎng)肝陰等效果[1-2]。主要有效成分為揮發(fā)油類、香豆素類、多糖類、苷類和聚炔類等,其中多糖類是含量最高的成分,具有抗氧化和調(diào)節(jié)機體免疫等功能[2-3]。

        目前,對于北沙參多糖的研究,主要集中于提取工藝優(yōu)化和生物活性研究,如榮立新等[4]通過制備陰虛小鼠模型,檢測脾臟NK細胞殺傷活力、T淋巴細胞轉(zhuǎn)化功能和小鼠血清抗綿羊紅細胞抗體IgM含量,發(fā)現(xiàn)北沙參多糖具有一定的免疫調(diào)節(jié)活性。相美榮等[5]通過星點設(shè)計-響應面法,優(yōu)化了北沙參多糖的熱水浸提工藝,得到北沙參多糖的最大提取率為10.78%。與傳統(tǒng)的熱水浸提工藝相比,超聲波輔助提取法因具有效率高、操作時間短、設(shè)備簡單等優(yōu)勢,在食品和中藥行業(yè)中有較好的應用[6]。但是,對于超聲波最優(yōu)工藝提取的北沙參多糖的理化性質(zhì)和生物活性未見相關(guān)研究報道。

        本試驗擬選用超聲波輔助提取法提取北沙參多糖,采用單因素試驗和響應面法對北沙參多糖的提取工藝進行優(yōu)化,并測定北沙參多糖的理化性質(zhì)和生物活性,為北沙參多糖成分的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 藥品與試劑

        北沙參:河北安國產(chǎn),經(jīng)河北中醫(yī)學院藥學院生藥教研室鄭玉光教授鑒定為傘形科珊瑚菜(GlehnialittoralisFr. schmidt ex Miq.)的根;

        α-葡萄糖苷酶:1.0×105U/g,上海源葉生物科技有限公司;

        1,1-二苯基-2-苦味基肼(DPPH):色譜純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;

        對硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG):分析純,上海阿拉丁生化科技有限公司;

        其他試劑為國產(chǎn)分析純。

        1.2 試驗儀器

        恒溫水浴鍋:HH-2型,江蘇金壇宏華儀器廠;

        旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:EYELAN-1100型,東京理化株式會社;

        超聲波清洗器:KS-300DE型,昆山潔力美超聲儀器有限公司;

        多功能中藥粉碎機:400Y型,永康市鉑歐玉金制品有限公司;

        紫外-可見分光光度計:UV-2550型,島津儀器制造有限公司;

        高速離心機:TGL-15B型,上海安亭科學儀器廠;

        電子分析天平:AL204型,梅特勒-托利國際貿(mào)易有限公司;

        差熱—熱重聯(lián)用熱分析儀:STD-2960型,美國TA儀器公司;

        傅里葉變換紅外光譜儀:S-100型,珀金埃爾默儀器有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 樣品前處理 取北沙參藥材200.0 g,粉碎,過40目篩,用3倍體積的95%乙醇回流提取2次,除去脂溶性成分,藥渣50 ℃干燥后,備用。

        1.3.2 單因素試驗

        (1) 超聲提取時間對多糖提取率的影響:固定超聲提取溫度60 ℃,液料比20∶1 (mL/g),分別考察超聲提取時間(10,20,30,40 min)對多糖提取率的影響。

        (2) 超聲提取溫度對北沙參多糖提取率的影響:在液料比20∶1 (mL/g)、超聲提取時間20 min的條件下,分別考察超聲提取溫度(20,40,60,80,90 ℃)對多糖提取率的影響。

        (3) 液料比對多糖提取率的影響:固定超聲提取溫度60 ℃,超聲提取時間20 min,分別考察液料比為[10∶1,15∶1,20∶1,25∶1,30∶1 (mL/g)]對多糖提取率的影響。

        1.3.3 響應面分析 在單因素考察的基礎(chǔ)上,以北沙參多糖提取率作為響應值,采用三因素三水平的響應面分析法,得到回歸方程,確定多糖的最佳工藝條件,并重復最優(yōu)工藝進行驗證實驗。所有試驗均重復3次,利用統(tǒng)計分析軟件Design Expert 8.0及Excel對試驗結(jié)果進行分析。

        1.3.4 北沙參多糖的理化性質(zhì)測定

        (1) 紫外-可見光譜分析:配制0.1 mg/mL的北沙參多糖溶液,用紫外-可見分光光度計在200~700 nm掃描[7]。

        (2) 紅外光譜分析:稱取1.0 mg的北沙參多糖,與KBr粉末混勻后壓片,紅外光譜儀在4 000~500 cm-1波數(shù)內(nèi)掃描[8]。

        (3) 總糖含量的測定:采用苯酚-硫酸法[9]。

        (4) 蛋白含量的測定:采用考馬斯亮藍法[10]。

        (5) 熱重分析:稱取2.0 mg的北沙參多糖,溫度由室溫升至800 ℃,升溫速率為10 ℃/min,進行熱重分析,包括:差示掃描量熱分析(differential scanning calorimetry,DSC)和熱解重量分析(thermal gravimetric analysis,TGA)[11]。

        1.3.5 北沙參多糖的生物活性

        (1) DPPH自由基清除能力:參照文獻[12]。

        (2) OH自由基清除能力:參照文獻[13]。

        (3) 對α-葡萄糖苷酶活性抑制:取pH 6.81緩沖溶液3 mL 和2 mmol/L PNPG溶液0.8 mL,37 ℃孵育20 min,加入40 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液1 mL,繼續(xù)反應20 min,加1.0 mol/L碳酸鈉1 mL終止反應,紫外-可見分光光度計在400 nm測吸光度值,為對照組A1。將體系中1 mLα-葡萄糖苷酶換為1 mL蒸餾水,其余條件不變,測定吸光度值,為空白組A2。

        取pH 6.81緩沖溶液2 mL、2 mmol/L PNPG 0.8 mL,分別加入1 mL濃度分別為8.0,4.0,2.0,1.0,0.5 mg/mL的多糖溶液,同上法進行反應,并測吸光度值,為樣品組A3。將體系中1 mLα-葡萄糖苷酶換為1 mL蒸餾水,其余條件不變,測定吸光度值,為樣品對照組A4[14]。阿卡波糖作為陽性對照品。按式(1)計算抑制率。

        (1)

        式中:

        R——抑制率,%;

        A1——對照組的吸光度;

        A2——空白組的吸光度;

        A3——樣品組的吸光度;

        A4——樣品對照組的吸光度。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 單因素試驗

        2.1.1 提取時間對多糖提取率的影響 由圖1可知,隨著超聲提取時間的延長,多糖提取率先上升后又趨于平緩,當提取時間超過20 min時,多糖的提取率不再發(fā)生明顯的變化。因在一定的時間內(nèi),超聲波的空化作用可提高多糖的提取率,但時間過長會由于機械剪切作用和熱量聚集,降解多糖,從而使得多糖提取率不再增加,甚至降低。因此,選取20 min的超聲提取時間作為Box-Behnken Design(BBD)試驗設(shè)計的中心點。

        圖1 提取時間對北沙參多糖提取率的影響

        Figure 1 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharide fromRadixGlehniae

        2.1.2 提取溫度對多糖提取率的影響 由圖2可知,隨超聲提取溫度的增加,多糖提取率先上升后趨于平緩,這是由于升高溫度有助于傳質(zhì)過程的發(fā)生,可加劇分子擴散,從而加快溶劑的滲透以及多糖類物質(zhì)的溶出。當提取溫度超過60 ℃ 時提取率上升已不明顯,而且提取溫度過高會難以控制試驗條件,浪費資源,所以選取60 ℃提取溫度為后續(xù)BBD試驗設(shè)計的中心點。

        2.1.3 液料比對北沙參多糖提取率的影響 由圖3可知,多糖提取率隨提取液料比的增加而增加,當液料比大于20∶1(mL/g)時,提取率趨于平緩。溶劑量的增加使得北沙參與提取溶液的接觸面積增大,溶劑傳質(zhì)推動力增強,可使得多糖提取率和溶出速度增加。但溶劑體積過大可導致物料吸附溶劑的量也增大,多糖被物料吸附不易溶出。因此,選取20∶1 (mL/g)的液料比作為后續(xù)BBD試驗設(shè)計的中心點。

        圖2 提取溫度對北沙參多糖提取率的影響

        Figure 2 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharide fromRadixGlehniae

        圖3 液料比對北沙參多糖提取率的影響

        2.2 北沙參多糖提取工藝優(yōu)化

        2.2.1 數(shù)學模型的建立與檢驗 基于上述單因素試驗結(jié)果,采用響應面法對北沙參多糖提取工藝進行優(yōu)化,以提取溫度、提取時間、液料比為自變量,多糖提取率(Y)為響應值,根據(jù)BBD試驗設(shè)計方法和原理,得出北沙參多糖提取率響應面分析試驗設(shè)計因素與水平表(表1)。

        表1 響應面分析試驗設(shè)計因素與水平

        采用BBD試驗設(shè)計方法設(shè)立17組試驗,各因素和響應面值(多糖提取率)如表2所示,對數(shù)據(jù)進行二次回歸擬合,分析各因素的效應,最后得到北沙參多糖提取最優(yōu)工藝。

        2.2.2 回歸方程的建立與方差分析 利用軟件對試驗結(jié)果進行回歸分析,擬合得到北沙參多糖提取率的二次多元回歸方程為:

        Y=11.76+0.62A+0.33B+0.25C+0.35AB+0.79AC-0.060BC-0.64A2-0.75B2-0.96C2。

        (2)

        表2 多糖提取率響應面試驗設(shè)計和結(jié)果

        Table 2 Response surface experimental design and result of polysaccharide extraction rate ofRadixGlehniae

        試驗號ABC提取率/%10-119.81200011.8731-1010.54411011.68510-19.576-1109.517-10-110.08800012.11910-19.691001-110.261100010.531200011.8713-1-109.78140-1-19.411500012.4416-1019.241701-110.35

        2.2.3 響應面分析 圖4~6是因素(提取溫度、提取時間、液料比)交互影響的響應面圖和等高線圖。由圖4可知,隨超聲提取溫度的升高,多糖提取率呈現(xiàn)先有所增加后緩慢降低的趨勢。超聲提取時間為15~25 min時,提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢;等值線區(qū)域水平,表示兩因素間具有顯著的交互作用。由圖5可知,隨提取溫度的升高,提取率呈現(xiàn)先增大后趨于平穩(wěn)的趨勢;隨液料比的加大,提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。由圖6可知,隨液料比的加大及超聲提取時間的延長,提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。

        2.3 最佳工藝參數(shù)及驗證

        通過對二次多項式回歸分析求最大值,得到超聲波輔助提取多糖的最佳工藝為:液料比22∶1 (mL/g)、超聲提取時間22.07 min、超聲提取溫度64.5 ℃,在此條件下,北沙參多糖提取率的理論預測值為12.17%,結(jié)合最優(yōu)工藝參數(shù)與實際生產(chǎn)可操作性,對各因素的取值進行修正,最終確定超聲波輔助提取最優(yōu)工藝為:液料比22∶1 (mL/g)、超聲提取時間22 min、提取溫度65 ℃,經(jīng)3次重復實驗驗證,北沙參多糖平均提取率為12.13%,與預測值相近,說明優(yōu)化工藝重復性良好,最優(yōu)工藝的結(jié)果可靠。

        表3 北沙參多糖提取率回歸模型方差分析

        Table 3 Analysis of extraction rate regression model variance ofRadixGlehniaepolysaccharide

        方差來源平方和自由度均方F值P值顯著性模型15.6491.745.090.021 7顯著A1.9211.925.610.049 7B0.5510.551.600.245 9C0.2110.210.600.462 8AB0.5010.501.460.266 9AC1.2111.213.540.101 9BC6.97E-0316.97E-030.020.890 5A21.4111.414.140.081 3B21.9511.955.710.048 2C21.8911.895.540.050 8殘差2.3970.34失擬項0.2610.260.720.427 3不顯著純誤差2.1360.36總回歸18.0316

        2.4 紫外-可見光譜分析蛋白類成分

        由圖7可知,北沙參多糖在280 nm處有一定的吸收峰,說明其可能含有蛋白類成分,蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定。

        圖4 提取溫度和提取時間對北沙參多糖提取率的交互影響

        圖5 提取溫度和液料比對北沙參多糖提取率的交互影響

        圖6 提取時間和料液比對北沙參多糖提取率的交互影響

        圖7 北沙參多糖紫外-可見光譜圖

        2.5 北沙參多糖中蛋白質(zhì)含量

        由標準曲線得到的回歸方程為y=0.690 71x+1.103 5(R2=0.991)。經(jīng)計算樣品中蛋白質(zhì)的含量為1.22%。

        2.6 北沙參多糖中總糖含量

        由標準曲線得到的回歸方程為b=9.1a+0.082 4(R2=0.998)。經(jīng)計算樣品中總糖含量為90.40%。

        2.7 紅外光譜分析特征官能團

        從圖8可以看出,在1 021.28 cm-1處吸收峰是醇羥基的C—O伸縮振動,1 155.97 cm-1處為環(huán)上C—O的振動峰,1 638.05 cm-1附近為—OH的彎曲振動吸收峰,1 414.14 cm-1處為C—H鍵的彎曲振動吸收峰,2 930.43 cm-1附近為多糖的C—H伸縮振動吸收峰,3 409.19 cm-1附近為O—H的伸縮振動峰,結(jié)果表明,樣品具有多糖類物質(zhì)典型特征峰[15-16]。

        圖8 北沙參多糖紅外圖譜

        2.8 羥基自由基清除能力

        由圖9可知,隨著樣品濃度的升高,北沙參多糖對羥基自由基的清除作用也逐漸增強,呈現(xiàn)濃度依賴性,當濃度為4.00 mg/mL時,北沙參多糖對羥基自由基的清除率為78.9%,北沙參多糖對羥基自由基的半數(shù)清除率濃度IC50值為1.71 mg/mL,但清除效果弱于對照品VC(IC50值為0.072 mg/mL)。

        圖9 北沙參多糖和VC對羥基自由基的清除作用

        Figure 9 The scavenging rates on hydroxyl radical ofRadixGlehniaepolysaccharide and VC

        2.9 DPPH自由基清除能力

        由圖10可知,隨著樣品濃度的升高,北沙參多糖對DPPH自由基的清除作用也逐漸增強,呈現(xiàn)濃度依賴性,當濃度為4.00 mg/mL時,北沙參多糖對DPPH自由基的清除率為70.2%,北沙參多糖對DPPH自由基的半數(shù)清除率濃度IC50值為1.99 mg/mL,但清除效果弱于對照品VC(IC50值為0.005 mg/mL)。

        圖10 北沙參多糖和VC對DPPH自由基的清除作用

        Figure 10 The scavenging rates on DPPH radical ofRadixGlehniaepolysaccharide and VC

        2.10 對α-葡萄糖苷酶的活性抑制

        由圖11可知,北沙參多糖對α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用,隨著濃度的升高,抑制作用也增強,整體呈線性關(guān)系。北沙參多糖對α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制率濃度IC50值為5.23 mg/mL。阿卡波糖的IC50值為0.501 mg/mL,對比可得,北沙參多糖低于陽性對照阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用。試驗結(jié)果表明北沙參多糖具有潛在的降血糖活性。

        圖11 北沙參多糖與阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

        3 結(jié)論

        本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上,利用響應面法對超聲波輔助提取北沙參多糖工藝進行了優(yōu)化,并對北沙參多糖的抗氧化活性及降血糖活性進行了測定。結(jié)果表明:北沙參多糖的最優(yōu)提取工藝為提取溫度65 ℃,提取時間22 min,液料比22∶1 (mL/g),在此條件下多糖提取率為12.13%。最優(yōu)工藝條件下制備的北沙參多糖具有多糖的典型特征吸收峰,總糖含量為90.4%,蛋白質(zhì)含量為1.22%,熱降解溫度為300.32 ℃。北沙參多糖具有一定的清除羥基自由基和DPPH自由基的能力和潛在的降血糖活性(對α-葡萄糖苷酶抑制率的IC50值為5.23 mg/mL)。

        本試驗僅在體外對北沙參多糖的活性進行了測定,并未進行體內(nèi)試驗,后續(xù)將對北沙參多糖的體內(nèi)抗氧化及降血糖活性進行研究。

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