費(fèi) 鵬趙勝娟姜亦超江 巖劉麗莉肖 楓張慧蕓唐浩國康懷彬

(1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；2. 長白山食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，吉林 白山 134500；3. 穆棱市食品檢驗(yàn)檢測中心，黑龍江 牡丹江 157500 )

空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)是常見的食源性致病菌之一，主要存在于家畜家禽等動物體內(nèi)，其中雞是最易攜帶該致病菌的動物[1-3]。中國是雞肉的消費(fèi)大國，食用未煮熟的雞肉是感染空腸彎曲桿菌的主要原因，感染該致病菌會導(dǎo)致患者腹瀉、關(guān)節(jié)炎和格林-巴利綜合征等疾病，嚴(yán)重地危害了消費(fèi)者的健康[4-5]?？漳c彎曲桿菌具有高度的遺傳多樣性，且對抗生素有較強(qiáng)的耐藥性，給充分認(rèn)識和有效控制該致病菌帶來了難題[6-7]。

對空腸彎曲桿菌遺傳多樣性的研究有助于揭示特定環(huán)境中該致病菌的種群特征，增加對空腸彎曲桿菌的認(rèn)識，該方向的研究已被研究者們關(guān)注[8-10]。陳荀等[11]利用脈沖場電泳技術(shù)對雞肉產(chǎn)業(yè)鏈中(糞便、屠宰場中雞肉)的空腸彎曲桿菌進(jìn)行了分型研究，結(jié)果表明，83株供試菌株被分為了45個(gè)不同的分子型，揭示了雞肉產(chǎn)業(yè)鏈中該致病菌的分子特征。脈沖場電泳技術(shù)的結(jié)果并不能揭示基因?qū)用娴男畔?，其結(jié)果也不能實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室之間的數(shù)據(jù)共享，而多位點(diǎn)序列分型(Multilocus Sequence typing，MLST)技術(shù)能夠彌補(bǔ)上述不足[12]。Ma等[6]利用MLST技術(shù)對天津地區(qū)市售雞肉中的空腸彎曲桿菌進(jìn)行了分析，研究發(fā)現(xiàn)42株空腸彎曲桿菌被分成了22個(gè)不同的序列型(Sequence Type，ST)，并分析了不同STs空腸彎曲桿菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。洪捷等[13]則利用MLST技術(shù)研究了分離自江蘇地區(qū)空腸彎曲桿菌的種群特征，31株空腸彎曲桿菌被分成了21個(gè)STs。上述報(bào)道一定程度上揭示了禽肉及雞肉產(chǎn)業(yè)鏈中空腸彎曲桿菌的遺傳多樣性，然而關(guān)于東北地區(qū)市售雞肉中的空腸彎曲桿菌種群特征的研究尚未見報(bào)道。

目前，使用抗生素是治療空腸彎曲桿菌感染最有效和常用的方法。然而，隨著抗生素的濫用和長時(shí)間的使用，菌株很有可能產(chǎn)生耐藥性。黃金林等[14]發(fā)現(xiàn)奶牛源的空腸彎曲桿菌具有多重耐藥性。周倩等[15]分析了禽源的空腸彎曲桿菌的耐藥性，發(fā)現(xiàn)了一株對92.6%的抗生素都具有耐藥性的菌株。Yang等[9]發(fā)現(xiàn)長時(shí)間的紅外突變處理能夠顯著地提高空腸彎曲桿菌桿菌對環(huán)丙沙星、萘啶酸、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、氟苯尼考、氯霉素和慶大霉素的耐受性。這些研究表明，對空腸彎曲桿菌進(jìn)行及時(shí)的耐藥性監(jiān)測是非常必要的。

本研究以東北地區(qū)市售雞肉為研究對象，對其空腸彎曲桿菌的污染情況進(jìn)行調(diào)查，利用MLST技術(shù)分析其遺傳多樣性，系統(tǒng)地揭示東北地區(qū)市售雞肉中空腸彎曲桿菌的種群特征。在此基礎(chǔ)上，對分離株進(jìn)行耐藥性監(jiān)測，以期為市售雞肉中空腸彎曲桿菌的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品采集：2017年1月～11月，采集東北地區(qū)市售的雞肉樣品1 000份，其中雞胸肉和雞翅各500份，用無菌棉簽擦拭(3 cm×3 cm)，并保存在磷酸鹽(phosphate buffered saline，PBS)緩沖液中，低溫保存運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室；

溶菌肉湯(Lysogeny Broth, LB)、PBS緩沖液、脫纖維綿羊血、CCDA選擇性培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；

21種藥敏紙片：北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

引物合成：蘇州金唯智生物科技有限公司；

細(xì)菌全基因組DNA試劑盒、2×PCR Master Mix：天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

高速臺式離心機(jī)：GT10-1型，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；

高壓滅菌鍋：SANYO型，上海迭戈生物科技有限公司；

恒溫培養(yǎng)箱：DNP-9272A型，常州諾基儀器有限公司；

電泳儀：BIO-RAD型，北京伯樂生命科學(xué)發(fā)展有限公司；

生物潔凈工作臺：BCW-1000型，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；

PCR儀：Veriti?型，北京昊諾斯科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 空腸彎曲桿菌的分離鑒定 根據(jù)周倩等[15]的方法，取100 μL PBS稀釋液，對其進(jìn)行分離純化。挑取單菌落，接種在5%脫纖維羊血的LB肉湯培養(yǎng)基中，在微需氧(10% CO2，5% O2，85% N2)、37 ℃的條件下培養(yǎng)48 h。吸取空腸彎曲桿菌菌液2 mL，根據(jù)細(xì)菌全基因組DNA試劑盒說明書對其進(jìn)行DNA提取，利用16S rRNA 測序技術(shù)進(jìn)行鑒定。

1.3.2 看家基因PCR擴(kuò)增及測序 按照Lévesque等[16]的報(bào)道合成引物(aspA、glnA、gltA、glyA、pgm、tkt和uncA)，以空腸彎曲桿菌 DNA 為模板，對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系(50 μL)為：DNA模板2 μL，2×PCR Master Mix 25 μL，雙蒸水23 μL。7對引物的反應(yīng)體系相同，均為：94 ℃預(yù)變性10 min，30個(gè)循環(huán)(94 ℃，1 min；50 ℃，1 min；72 ℃，1 min)，最后72 ℃延伸10 min。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測序分析。

1.3.3 空腸彎曲桿菌MLST分析 登陸空腸彎曲桿菌MLST數(shù)據(jù)庫(http://pubmlst.org/campylobacter/)，將看家基因的基因測序結(jié)果在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，得到7個(gè)看家基因的等位基因號，并根據(jù)7個(gè)等位基因號確定空腸彎曲桿菌的序列型(Sequence Type，ST)，并利用MEGA6.0軟件對串序列進(jìn)行最小似然系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.3.4 空腸彎曲桿菌的耐藥性分析 選取8種抗生素，利用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)推薦的K-B瓊脂擴(kuò)散法，分析空腸彎曲桿菌的耐藥性。將活化的菌液稀釋至0.5麥?zhǔn)蠞舛?，然后根?jù)藥敏紙片說明書進(jìn)行測試，在微需氧、37 ℃ 的條件下培養(yǎng)48 h，根據(jù)抑菌圈直徑的大小(mm)按CLSI/NCCLS評估空腸彎曲桿菌的耐藥性。

2 結(jié)果與分析

2.1 東北地區(qū)市售雞肉中空腸彎曲桿菌的污染情況

東北地區(qū)1 000份市售雞肉中共有62份空腸彎曲桿菌陽性樣品，總污染率為6.2%，具體見表1。62份陽性樣品中雞胸肉樣品37份(7.4%)，雞翅樣品25份(5.0%)，可見雞胸肉中空腸彎曲桿菌的污染率高于雞翅。東北5個(gè)不同地區(qū)市售雞肉空腸彎曲菌的污染率分別為5.5%(A)、5.5%(B)、7.5%(C)、6.0%(D)、6.5%(E)。在2012年和2013年的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)雞肉中空腸彎曲桿菌的污染分別為11.5%[17]和1..66%[18]，本研究中東北地區(qū)市售雞肉中該致病菌的污染率為6.2%，明顯低于之前的污染率。

表1 東北地區(qū)市售雞肉空腸彎曲桿菌污染情況?

Table 1 The contamination ofC.jejuniin commercial chicken in Northeast China

%

? 樣品數(shù)為100。

2.2 東北地區(qū)市售雞肉中空腸彎曲桿菌的MLST分析

將62株空腸彎曲桿菌看家基因的序列在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，得到看家基因等位基因號和ST，結(jié)果見表2。62株空腸彎曲桿菌被分為了14個(gè)ST，分別為ST1(15株)、ST5(24株)、ST28(2株)、ST52(4株)、ST64(4株)、ST88(3株)、ST90(1株)、ST236(1株)、ST456(2株)、ST751(1株)、ST905(1株)、ST1222(2株)、ST3228(1株)和ST3242(1株)，說明該致病菌具有較高的遺傳多樣性。其中ST5和ST1型的空腸彎曲桿菌分別占總菌株數(shù)的31.87% 和24.19%，是雞肉中空腸彎曲桿菌的優(yōu)勢ST。在董俊等[19]的研究中顯示分離自湖北地區(qū)禽類的空腸彎曲桿菌的優(yōu)勢ST353和ST464。這些與本研究的結(jié)果并不一致，是因?yàn)榭漳c彎曲桿菌的分離地區(qū)和來源不同，說明不同地區(qū)和來源的空腸彎曲桿菌在種群組成上存在差異。

表2 62株空腸彎曲桿菌MLST分析結(jié)果

2.3 不同ST空腸彎曲桿菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

以不同ST的空腸彎曲桿菌看家基因串聯(lián)序列為研究對象，利用MEGA6.0軟件構(gòu)建最小似然算法系統(tǒng)發(fā)育樹，得到了清晰的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)果見圖1。在14個(gè)不同的ST中，ST90和ST456，ST88和ST1222之間具有較近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，說明上述2組ST的菌株可能具有相近的生物學(xué)特性和侵染特性。ST3242明顯遠(yuǎn)離了其他13個(gè)ST，說明ST324的空腸彎曲桿菌與其他菌株親緣上有一定的距離，因此該菌株應(yīng)該進(jìn)行進(jìn)一步的研究，確定其是否有獨(dú)特的侵染和致病能力。

圖1 不同ST空腸彎曲桿菌7個(gè)看家基因串聯(lián)序列最小似然系統(tǒng)發(fā)育樹

Figure 1 Maximum-likelihood tree of splicing sequence of 7 housekeeping genes inC.jejuniwith different STs

2.4 空腸彎曲桿菌耐藥性分析

62株空腸彎曲桿菌對8種抗生素的耐藥性分析結(jié)果見表3，在8種抗生素中對環(huán)丙沙星和復(fù)方新諾明的耐受率為0%，對其他6種抗生素的耐受率分別為91.94%(紅霉素),88.71%(慶大霉素),74.19%(克林霉素),38.71%(青霉素),25.81%(四環(huán)素),6.45%(頭孢噻肟)。這些結(jié)果表明空腸彎曲桿菌對大多數(shù)的抗生素都產(chǎn)生了耐藥性，而所有的受試菌株都不耐受環(huán)丙沙星和復(fù)方新諾明，因此可以利用這2種抗生素預(yù)防和治療空腸彎曲桿菌的感染。

表3 62株空腸彎曲桿菌耐藥性分析

3 結(jié)論

本研究調(diào)查了東北地區(qū)市售雞肉中空腸彎曲桿菌的污染情況，其污染率為6.2%。62株空腸彎曲桿菌被分為了14個(gè)ST，分別為ST1、ST5、ST28、ST52、ST64、ST88、ST90、ST236、ST456、ST751、ST905、ST1222、ST3228和ST3242，其中ST5和ST1為優(yōu)勢的STs，說明空腸彎曲桿菌具有豐富的遺傳多樣性。抗生素耐藥性分析表明空腸彎曲桿菌對環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明和頭孢噻肟具有高度的敏感性，而對紅霉素、慶大霉素、克林霉素、青霉素和四環(huán)素的耐受性較強(qiáng)。本研究的結(jié)果有助于了解東北地區(qū)市售雞肉中空腸彎曲桿菌的污染情況、種群特征和抗生素耐藥性，為了進(jìn)一步揭示環(huán)境對空腸彎曲桿菌種群特征的影響，接下來的研究將用更為先進(jìn)的全基因組測序技術(shù)分析空腸彎曲桿菌的遺傳進(jìn)化特性，并挖掘與耐藥性相關(guān)的功能基因。