楊 芳劉 鐵劉 燕王 沙王丹紅

(1. 安康學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，陜西 安康 725000；2. 陜西省蠶桑重點實驗室，陜西 安康 725000；s3. 安康學(xué)院數(shù)學(xué)與統(tǒng)計學(xué)院，陜西 安康 725000)

桑葚營養(yǎng)豐富，具有良好的保健功能。相較于中國豐富的桑葚資源，目前圍繞桑葚開發(fā)利用的產(chǎn)品數(shù)量、質(zhì)量還遠遠不夠。桑葚因其果肉多汁、香氣幽雅、色素含量高且穩(wěn)定是釀酒的極佳原料[1]。桑葚中黃酮類化合物具有增強毛細血管強度、抗自由基[2]、抗病毒[3-4]、抗炎、調(diào)節(jié)血脂、對抗膳食丙烯酰胺引發(fā)的細胞毒性等生物學(xué)活性[5]。果酒中有機酸含量的高低與果酒品質(zhì)有著密切的關(guān)系[6]。有機酸具有抑菌、抗病毒、增加冠動脈流量、抑制腦組織脂質(zhì)過氧化等作用。桑葚中有機酸以檸檬酸為主[7]。有機酸同時也是決定果酒口感的重要風(fēng)味物質(zhì)。乙醇是影響果酒香味和滋味的重要化學(xué)成分。乙醇含量過高，酒香蓋住了果香。乙醇含量過低，不僅酒體缺失酒香，也缺少了酒類飲料特有的醇厚純凈。糖類物質(zhì)是果酒發(fā)酵的主要成分，也是果酒中乙醇、有機酸產(chǎn)生的重要來源。果酒中殘存的總糖成為衡量果酒品質(zhì)的重要理化指標之一。

黃正勇等[8]的研究指出桑葚果酒發(fā)酵過程質(zhì)量控制的3個要素分別為蔗糖添加量、酵母菌的選擇及接種量、發(fā)酵溫度及時間控制。前期研究利用星點設(shè)計—響應(yīng)面優(yōu)化的桑葚果酒發(fā)酵工藝發(fā)酵溫度為15.3 ℃[9]，低于文獻[8,10]報道的推薦溫度20 ℃，釀制的桑葚果酒乙醇含量達14%[9]。本試驗分析該工藝條件下桑椹果酒發(fā)酵過程中總糖、總酸、乙醇、總黃酮的變化規(guī)律，同時對該工藝條件下桑椹果酒香氣成分進行分析，確定發(fā)酵總時間，以期為發(fā)酵型桑葚果酒的進一步開發(fā)提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 桑葚及酵母菌

桑葚：大十新鮮桑葚，產(chǎn)自陜西省安康市漢濱區(qū)張灘鎮(zhèn)；

高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.2 儀器

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：GCMS-QP2010型，日本島津公司；

氣相色譜儀：Agilent 7890A型，配Agilent DB-5氣相毛細管色譜柱，美國Agilent公司；

微量冷凍高速離心機：Thermo Legend Micro17R型，美國Thermo公司。

1.3 試劑

石油醚、無水硫酸鈉、氯化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、冰乙酸：分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；

硝酸鋁：分析純，天津市百世化工有限公司；

槲皮素：標準品，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

無水葡萄糖：標準品，大連美侖生物技術(shù)有限公司；

甲醇、乙醇、三氯甲烷：色譜純，天津益仁達化工有限公司。

1.4 方法

1.4.1 發(fā)酵工藝 桑葚清洗后瀝干，粉碎后全果漿發(fā)酵。桑葚果酒發(fā)酵工藝條件：發(fā)酵溫度15.3 ℃、接種量8.00 g/L、蔗糖加入量12.80 g/100 g。發(fā)酵總時間為24 d。每3 d測1次，平行測3次，取平均值。

1.4.2 總糖含量的測定 采用3，5-二硝基水楊酸法(DNS法)[11]。

1.4.3 總酸含量的測定 用鄰苯二甲酸氫鉀作基準物質(zhì)標定NaOH溶液。發(fā)酵型桑葚果酒12 000 r/min離心10 min后，移取上清液2 mL至離心管。用NaOH標準溶液進行滴定，利用pH計來調(diào)節(jié)終點電位與預(yù)控電位。滴定終點電位是8.3[12]。記錄此時消耗的氫氧化鈉的體積。按式(1)計算發(fā)酵型桑葚果酒總酸含量。

(1)

式中：

s——總酸含量，g/L；

c——NaOH標準溶液濃度，g/mL；

k——檸檬酸系數(shù)[13]104；

v1——NaOH標準溶液消耗體積，mL；

v2——發(fā)酵型桑葚果酒上清液取樣體積，L。

1.4.4 總黃酮的測定 采用聚酰胺吸附—硝酸鋁顯色法[13]105，以槲皮素為標準品[14]繪制標準曲線。

1.4.5 乙醇含量的測定 采用氣相色譜法[15]。GC條件：DB-5氣相毛細管色譜柱(30 m× 320 μm，0.25 μm)；進樣口溫度220 ℃；分流進樣，分流比為20∶1；程序升溫，40 ℃保持4 min，然后以3.5 ℃/min升至50 ℃，再以25 ℃/min升至200 ℃；檢測器FID，檢測器溫度220 ℃，氫氣流量30 mL/min，空氣流量400 mL/min，尾吹流量11.5 mL/min；恒流模式，流速0.5 mL/min。

制作標準曲線：精密量取乙醇標準品稀釋，使?jié)舛确謩e成為0.02，0.05，0.10，0.20，0.30 mL/100 mL的系列對照品溶液，進樣量1 μL，測定峰面積，按內(nèi)標法以峰面積計算。

每個果酒樣品取200 μL，用純水稀釋至10 mL后過濾上樣，進樣量1 μL。故計算時的稀釋體積為50倍，每個樣品處理2次分別進單針得到結(jié)果。

1.4.6 香氣成分的檢測 參考文獻[13]128-129。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖含量的測定線性關(guān)系

葡萄糖標準液的濃度為1 mg/mL，以標準液的濃度0.000，0.008，0.016，0.024，0.032，0.04，0.048 mg/mL為橫坐標，以其對應(yīng)的吸光值(OD值)為縱坐標，繪制標準曲線，得直線回歸方程為Y=14.179X-0.000 7(R2=0.994 4)，表明在濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 乙醇的測定線性關(guān)系考察

精密量取乙醇溶液，并進行稀釋，使?jié)舛确謩e成為0.02，0.05，0.10，0.20，0.30 mL/100 mL的系列對照品溶液，進樣，測定。以乙醇體積百分比(X)對峰面積積分值(Y)進行線性回歸，得回歸方程y=2 669.819 277 0x+1.404 216 9,R2=0.999 978 1。乙醇標準品氣相色譜圖、桑葚果酒色譜圖分別見圖1、2。

2.3 槲皮素的測定線性關(guān)系考察

槲皮素標準品濃度為424.0 μg/mL，以標準品的濃度(0.00，8.48，16.96，25.44，33.92，42.40，50.88，59.36 mg/L)為橫坐標，以其對應(yīng)的吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y=0.007 2X-0.002 3(R2=0.999 7)，表明在濃度范圍內(nèi)(8.48～59.36 mg/L)線性關(guān)系良好。

2.4 桑葚果酒發(fā)酵過程中總糖、總酸、乙醇、總黃酮動態(tài)測定

桑葚果酒發(fā)酵過程中總糖、總酸、乙醇、總黃酮動態(tài)測定結(jié)果見圖3。

由圖3看出，發(fā)酵過程中總糖含量處于先迅速下降后趨于平緩的過程。發(fā)酵最初9 d糖的消耗量最大，最后慢慢趨于平緩。桑葚果酒發(fā)酵過程中，總酸含量變化呈現(xiàn)上升趨勢，達到最大值后趨于相對穩(wěn)定。在發(fā)酵第15～18天時樣品的總酸含量介于5～6 g/L，第24天達到6.61 g/L。桑葚果酒總黃酮從發(fā)酵第15天的 274.83 mg/L增長到發(fā)酵第21天的最大值(417.19 mg/L)。

圖1 乙醇標品色譜圖

圖2 桑葚果酒色譜圖

2.4.1 總糖含量的變化 桑葚果漿中總糖是釀酒酵母菌生長所需的碳源?？偺堑南牧块g接反映釀造過程酵母菌生長速度的變化歷程。在桑葚果酒發(fā)酵最初階段，酵母菌活性較好，大量消耗了試驗中加入的蔗糖和桑葚本身所含的糖分。隨著時間的推移，酵母菌活性不斷下降，酵解速度趨于平緩，直至發(fā)酵完全。研究[16]38-39報道桑椹果酒發(fā)酵初始糖濃度會影響菌種對數(shù)生長期的出現(xiàn)時間。在桑葚汁初始糖濃度為180～280 g/L時，隨桑椹果酒發(fā)酵初始糖濃度的增加，酵母菌對數(shù)生長期的出現(xiàn)時間會推遲。高濃度的初糖會阻遏乙醇脫氫酶產(chǎn)生，對果酒發(fā)酵有抑制作用，同時導(dǎo)致高滲透壓，不利于酵母菌的生長。初糖濃度為180 g/L時桑葚汁釀造過程中釀酒酵母對數(shù)成長期在發(fā)酵第3天。本款桑葚果酒釀造初始糖濃度為202.78 g/L，發(fā)酵第3天降至35.10 g/L，表現(xiàn)出發(fā)酵第7天果酒總糖消耗最大。文獻[6]報道桑葚果酒發(fā)酵第9天，桑葚果酒中的還原糖含量降低至原來的5%，降至發(fā)酵最低水平。

溫度是發(fā)酵工藝控制的重要參數(shù)。桑葚果酒發(fā)酵溫度多推薦在20 ℃左右[8,10]。酵母菌的接種量也是決定酵母菌是否能快速成為發(fā)酵優(yōu)勢菌的關(guān)鍵因素。接種量過少會導(dǎo)致發(fā)酵過程緩慢，釀造周期偏長；接種量過高會導(dǎo)致發(fā)酵過程過于迅速，不容易積累目標代謝產(chǎn)物。研究[17]報道最適的酵母接種量為5.00～7.00 g/L。本次發(fā)酵工藝參數(shù)中發(fā)酵溫度15.3 ℃、接種量8.00 g/L、蔗糖加入量12.80 g/100 g。在此工藝條件下，發(fā)酵1周后桑葚果酒總糖含量降低明顯，最終桑葚果酒中殘?zhí)菫?3.27±0.006) g/L。

圖3 桑葚果酒發(fā)酵過程中總糖、總酸、乙醇、總黃酮含量變化

2.4.2 乙醇含量的變化 從發(fā)酵開始到第3天，乙醇濃度快速升高。果酒發(fā)酵至第15天乙醇含量迅速升高，于第18天達到新的平臺值。在本款桑葚果酒發(fā)酵工藝條件下，乙醇的動態(tài)變化曲線呈現(xiàn)“S”型的特點。這可能與15.3 ℃ 發(fā)酵溫度，低于釀酒酵母菌生長的最適溫度20 ℃，導(dǎo)致最初發(fā)酵速度緩慢有關(guān)。在果酒發(fā)酵過程中，乙醇的大量積累會嚴重影響酵母細胞的生長，通過影響細胞形態(tài)、生理活動以及酶活性對酵母細胞產(chǎn)生脅迫。本款桑葚果酒釀造工藝由于最初發(fā)酵速度緩慢，乙醇濃度尚未對酵母菌的生長、發(fā)酵產(chǎn)生明顯的反饋抑制，在發(fā)酵第18～24天乙醇含量穩(wěn)定在14%左右。

2.4.4 總黃酮含量的變化 發(fā)酵過程中，桑葚果實中的黃酮逐漸釋放，在微生物作用下大部分黃酮苷被降解為苷元，并溶于果酒中。

2.5 發(fā)酵型桑葚果酒的香氣成分分析

桑椹果酒GC-MS所得到的總離子流圖見圖4、5。圖中峰形、離子豐度和分離度均較好，滿足分析的要求。將分離得到的單組份色譜峰對應(yīng)的質(zhì)譜圖與NIST11譜庫中質(zhì)譜圖進行檢索匹配，分離得到的所有組分對應(yīng)質(zhì)譜檢索相似度匹配率均>80%，鑒定結(jié)果列于表1、2中。

發(fā)酵第18天桑葚果酒香氣成分檢測到的醇類物質(zhì)有10種，相對含量占43.5%；酸類物質(zhì)有9種，相對含量占25.0%；酯類物質(zhì)有8種，相對含量占16.1%；醛酮類物質(zhì)相對含量占13.8%；3-烯丙基-6-甲氧基苯酚相對含量占1.6%。發(fā)酵第24天桑葚果酒香氣成分檢測到的醇類物質(zhì)有7種，相對含量占34.5%；酸類物質(zhì)有9種，相對含量占31.1%；酯類物質(zhì)有6種，相對含量占12.7%；醛酮類物質(zhì)相對含量占8.1%；高絲氨酸相對含量占7.7%；烷類物質(zhì)相對含量占5.8%。其中有因具備愉快氣味成為酯類香料的物質(zhì)，如丁二酸二乙酯；呈椰子和鳶尾似香氣和甜蜂蠟似風(fēng)味的十四酸乙酯；呈微弱蠟香、果爵和奶油香氣十六酸乙酯；呈鮮花香氣的十八烯酸乙酯；略呈蠟香的十八酸乙酯?？梢员挥米魇秤孟懔系乃犷愇镔|(zhì)如2-甲基丁酸、丁酸、己酸、苯甲酸、棕櫚酸。3-羥基-2-丁酮被高倍數(shù)稀釋后會產(chǎn)生香甜的奶香氣，在酒類調(diào)香中占有重要地位。甘油醛是酵母菌糖酵解過程產(chǎn)生的中間代謝物，有一定的甜味，作為風(fēng)味物質(zhì)。莽草酸既可以作為保香物質(zhì)，還具備一定藥用活性。該物質(zhì)通過影響花生四烯酸代謝，發(fā)揮抑制血小板聚集作用，從而抑制動、靜脈血栓形成。亞油酸乙酯和亞油酸，尤其是亞油酸乙酯，均具備降低膽固醇和血脂的作用，對動脈粥樣硬化癥有預(yù)防保健作用。未檢測到酒香酵母菌產(chǎn)生的具有馬廄味的4-乙基苯酚，脂肪臭味的異戊酸等影響果酒香氣的成分。

圖4 桑葚果酒發(fā)酵第18天香氣成分GC-MS總離子流色譜圖

圖5 桑葚果酒發(fā)酵第24天香氣成分GC-MS總離子流色譜圖

比較第18天和第24天果酒香氣成分，均以醇類和酸類構(gòu)成香氣成分的主體，其中酯類含量相對較少。第24天果酒香氣成分相較第18天，醇類物質(zhì)相對含量降低，酸類物質(zhì)相對含量增高，酯類物質(zhì)相對含量降低。發(fā)酵第18天果酒中含有正己醇和異丁醇2種高級醇，相對含量較少，可以賦予發(fā)酵型桑葚果酒芳香氣味，提供豐富飽滿的口感。北京、河北、云南不同產(chǎn)地桑葚釀造的果酒香氣成分分析報道中，不同產(chǎn)地的桑葚果酒香氣成分醇、酸、酯之間的比例差異較大[18]。本次發(fā)酵工藝條件下，桑葚果酒香氣成分醇、酸、酯之間的比例與文獻[18]報道的河北產(chǎn)地桑葚果酒比較接近。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)因其所具有的強大富集、分離和定性能力成為桑葚果酒香氣成分鑒定領(lǐng)域最有效的分析手段。目前，樣品前處理方法主要選用溶劑萃取法和頂空固相微萃取法。在檢索到的桑椹果酒香氣成分文獻中，桑葚果酒香氣成分差異較大。桑葚原材料、酵母菌種、發(fā)酵工藝、陳釀時間等因素的不同均會導(dǎo)致桑葚果酒香氣成分的檢測結(jié)果出現(xiàn)差異。一方面是參與貢獻桑葚果酒香氣的醇類、醛酮類、酯類、酸類、苯環(huán)及酚類、烷類各自所占百分比不同。另外，每款果酒的主要香氣成分組成也存在差異，除苯乙醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯外，其他組分各不相同。在檢索到的桑葚果酒香氣成分文獻中[13]126-128[18-19]，被重復(fù)檢測到的醇類物質(zhì)包括2-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇、苯乙醇、苯甲醇、己醇、壬醇、2，3-丁二醇；被重復(fù)檢測到的酸類物質(zhì)包括己酸、乙酸、2-甲基丁酸、癸酸、油酸；被重復(fù)檢測到的酯類物質(zhì)包括乙酸乙酯、丁二酸二乙酯、十六酸乙酯、十四酸乙酯、棕櫚酸乙酯、癸酸乙酯、亞油酸乙酯、辛酸乙酯。對照桑葚汁香氣成分[13]122-124[18-20]，同時在桑葚果汁和桑葚果酒中被重復(fù)檢測到的醇類物質(zhì)包括苯乙醇、己醇；被重復(fù)檢測到的酸類物質(zhì)包括己酸、乙酸、丁酸、亞油酸、棕櫚酸；被重復(fù)檢測到的酯類物質(zhì)包括乙酸乙酯、十六酸乙酯、十四酸乙酯、癸酸乙酯、亞油酸乙酯、辛酸乙酯。

表1 桑葚果酒發(fā)酵第18天香氣成分分析

表2 桑葚果酒發(fā)酵第24天香氣成分分析

關(guān)于酒體香氣成分中乙醇的檢出，不同的文獻[19,21-22]報道結(jié)果有差異，文獻[19]檢測出桑葚果酒中的乙醇，其他均未報道。這可能與樣品的前處理方法以及和質(zhì)譜檢測的動態(tài)范圍有關(guān)，含量達不到或者超過檢測范圍均不被檢測到。

3 結(jié)論

從桑葚果酒發(fā)酵主要成分動態(tài)變化規(guī)律來看，在發(fā)酵溫度15.3 ℃、接種量8.00 g/L、蔗糖加入量12.80 g/100 g的工藝條件下，發(fā)酵總時間可以縮短到18 d，果酒中殘存的總糖、總酸、乙醇含量均在較佳范圍，但總黃酮處于上升期，尚未到達最大值。本款發(fā)酵型桑葚果酒醇類和酸類構(gòu)成香氣成分的主體，其中酯類含量相對較少，賦予了本款發(fā)酵型桑葚果酒主要香氣特征。