彭 昆，高文強(qiáng)，邱雪峰，陳 蔚，張士偉，郭宏騫

(1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院泌尿外科，江蘇南京 210008；2.南京大學(xué)泌尿外科學(xué)研究所，江蘇南京 210008；3.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210009)

盆腔惡性腫瘤如宮頸癌、直腸癌、前列腺癌及膀胱癌，放療是部分早期腫瘤的一線治療手段以及大部分的晚期腫瘤的重要姑息治療手段。由于盆腔空間狹小，各臟器之間十分接近，大劑量的盆腔放射治療容易導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，如放射性腸炎、放射性致性腺損傷、放射性膀胱炎等等[1-4]。出血性放射性膀胱炎是比較常見的并發(fā)癥，急性期主要表現(xiàn)為膀胱內(nèi)壁廣泛炎癥，慢性期主要表現(xiàn)為膀胱壁的纖維化以及彌漫性的出血[5-6]?，F(xiàn)有的臨床治療無(wú)法有效逆轉(zhuǎn)慢性期膀胱組織發(fā)生的病理改變[7-8]。有文獻(xiàn)報(bào)道降低早期急性期損傷有助于減輕和緩解膀胱組織纖維化改變[5,9-10]。

雖然放射性損傷的相關(guān)機(jī)制尚未完全探明，但是已有文獻(xiàn)證明氧化應(yīng)激在各種組織的早期射線損傷中發(fā)揮了重要作用[5,9]。因此，在膀胱遭受放射性損傷早期，抗氧化應(yīng)激治療如清除和抑制氧自由基可以成為重要的預(yù)防以及治療手段[11]。核因子 E2 相關(guān)因子(Nuclear-factor-E2-related factor，Nrf2)及抗氧化反應(yīng)原件(antioxidant response element，ARE)信號(hào)通路Nrf2-ARE是機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷的防御性通路。研究表明，Nrf2-ARE 信號(hào)通路在細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷機(jī)制中發(fā)揮了舉足輕重的作用，也提示我們 Nrf2-ARE 信號(hào)通路是抗氧化損傷治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)[12-14]。丹參酮I(Tanshinone I，T-1)是中藥丹參根的乙醚提取物中的成份，具有高效的抗氧化作用。本實(shí)驗(yàn)室之前已進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明丹參酮I對(duì)放射性膀胱炎有保護(hù)作用，但是作用的方式尚未明了[15]。有研究已經(jīng)證明丹參酮I通過(guò)Nrf2-ARE通路在很多器官和組織氧化應(yīng)激中起到了保護(hù)作用，如紫外線引起的皮膚損傷以及砷引起的肺損傷[16-17]。但是尚未有丹參酮I通過(guò)Nrf2-ARE通路對(duì)放射性膀胱炎的保護(hù)作用的研究報(bào)告。我們假設(shè)丹參酮I通過(guò)Nrf2-ARE 信號(hào)通路減輕射線早期引起的氧化應(yīng)激，從而在放射性膀胱炎早期中起到保護(hù)作用。因此，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通過(guò)體內(nèi)和體外兩部分探索T-1對(duì)放射性膀胱炎早期保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組人膀胱上皮永生化細(xì)胞(SV-40 immortalized human bladder cells,SV-HUC-1)購(gòu)買自中科院細(xì)胞庫(kù)，接種于含12%胎牛血清(美國(guó) HyClone 公司)的高糖DMEM/F12(美國(guó) Gibico公司)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為5% CO2、37 ℃。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90% 時(shí)，0.25% 胰酶消化完全后吹打離心，以1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)。SV-HUC-1細(xì)胞接種于96孔板(約5 000個(gè)/孔)分為以下4組：對(duì)照組(Control)不進(jìn)行任何處理，T-1處理組(T-1)僅用丹參酮Ⅰ(3 μmol/L，美國(guó) Sigma 公司)處理48 h，X-射線照射組(X-ray)利用直線加速器(西門子，6-MV X射線，2 Gy/min)模擬放射性損傷(劑量為10 Gy)，T-1治療組(X-ray+T-1)接受X射線照射后丹參酮Ⅰ處理48 h。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞活力測(cè)定 使用CCK-8試劑盒(Vazyme Biotech，中國(guó)南京)，將SV-HUC-1細(xì)胞接種于96孔板(5000個(gè)/孔)，按上述分組處理后48 h，加入含10% CCK-8試劑的培養(yǎng)基100 μL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，在450 mm測(cè)量波長(zhǎng)及630 mmm修正波長(zhǎng)下檢測(cè)各組吸光度(A)值測(cè)定細(xì)胞活力。

1.2.2細(xì)胞內(nèi)活性氧水平檢測(cè) 使用活性氧檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Sigma 公司)，將SV-HUC-1細(xì)胞接種于6孔板，按上述“細(xì)胞培養(yǎng)及分組”方法隨機(jī)分組并予以相應(yīng)處理，48 h后去除培養(yǎng)基，用無(wú)血清培養(yǎng)基清洗2遍，加入1/1 000稀釋的DCFH-DA熒光試劑，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育20 min，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗凈游離的DCFH-DA，在激發(fā)波長(zhǎng)為502 mm，發(fā)射波長(zhǎng)530 mm，以熒光顯微鏡觀測(cè)7′-二氯熒光素(7′-Dichlorofluorescein,DCF)熒光，綠色熒光反應(yīng)了細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。使用image-pro Plus 6.0 進(jìn)行半自動(dòng)化定量分析，測(cè)量積分度(IA)和面積(area)，計(jì)算出平均度。

1.2.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與分組 ICR雌性小鼠(20～25 g，購(gòu)買自南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心)隨機(jī)分為如下4組：對(duì)照組(Control)10只，T-1處理組(T-1)10只，X-射線照射組(X-ray)10只，T-1治療組(X-ray+T-1)10只。T-1處理組和T-1治療組予以腹腔注射T-1 10 d，劑量為10 mg/(kg·48 h)，丹參酮I溶于橄欖油中，對(duì)照組和X-射線照射組腹腔注射相同劑量的橄欖油[16,18]。之后X-射線照射組和T-1治療組予以X線盆腔照射，照射后繼續(xù)按照之前方案腹腔注射丹參酮I或橄欖油，X線照射3 d和7 d后各處死5只小鼠，留取膀胱組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4小鼠放射性膀胱炎模型 使用氯胺酮(100 mg/kg)和咪達(dá)唑侖(5 mg/kg)混合物腹腔注射麻醉ICR雌性小鼠。麻醉完全后固定小鼠，使用直線加速器(西門子，6-MV X射線，2 Gy/min)照射小鼠骨盆，劑量為20 Gy[19]。

1.2.5總蛋白質(zhì)提取 使用RIPA裂解液(Beyotime，中國(guó)上海)，將各組細(xì)胞按1.1中方法隨機(jī)分組并予以相應(yīng)處理，48 h后去除培養(yǎng)基，用PBS清洗2遍后刮下細(xì)胞，將各組小鼠膀胱組織按上1.4中方法予以相應(yīng)處理。首先在RIPA裂解液中加入蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑，向洗凈的細(xì)胞或已制備好的組織勻漿中加入適量的蛋白裂解液，冰上靜置10 min，4 ℃，12 000 r/min 20 min，得到的上清液即為細(xì)胞或組織總蛋白。取2 μL 樣品加入到96孔板中，加入200 μL聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid,BCA)試劑(Beyotime，中國(guó)上海)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min，在562 mm測(cè)量波長(zhǎng)測(cè)量每組吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。

1.2.6Western blot試驗(yàn) 將配置好的SDS-PAGE膠固定于垂直槽電極架上，加入足量的1× Running buffer，泳道中加入各組蛋白樣品，每孔上樣量為含20 μg蛋白質(zhì)的溶液體積，連接電泳儀，80 V穩(wěn)壓電泳，溴酚藍(lán)至凝膠底邊即可停止電泳，使用半干式轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上，5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h。根據(jù)蛋白marker裁剪PVDF膜，將條帶加入對(duì)應(yīng)的抗體稀釋液中，4 ℃搖床過(guò)夜，一抗包括Nrf2、GCLC、NQO-1、HMOX-1、GPX2、α-Tubulin (Abcam Inc，Cambridge，MA，USA)。次日使用TBST清洗條帶，用二抗包被PVDF膜，室溫孵育1 h，脫色搖床上TBST清洗后使用化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析儀獲取化學(xué)發(fā)光圖像。

1.2.7超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測(cè) 利用SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所)，根據(jù)說(shuō)明書步驟，處死各組小鼠后留取膀胱組織，制備5%組織勻漿，于4 ℃，3 000 r/min離心10 min后使用黃嘌呤氧化酶法(WST-1法)測(cè)定SOD活力，使用BCA試劑盒(Signalway Biotechnology LLC，美國(guó))測(cè)量勻漿蛋白濃度。

1.2.8組織病理學(xué)分析 將小鼠膀胱組織固定于4% 多聚甲醛中，24 h后脫水并用石蠟包埋，脫蠟后再次水化，切片使用蘇木素和曙紅(HE)染色，干燥后使用封片液封片。

1.2.9圖像定量分析 盲選法選擇切片，每組小鼠膀胱至少選取10張切片，每高倍鏡視野下隨機(jī)選取1至2處非重疊連續(xù)黏膜，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件計(jì)算黏膜厚度和黏膜長(zhǎng)度，進(jìn)而計(jì)算平均黏膜厚度。

2 結(jié) 果

2.1T-1對(duì)X射線處理后細(xì)胞活力的影響結(jié)果如圖1A所示，Control組和T-1組無(wú)明顯差異，X-ray組的細(xì)胞活力下降明顯。X-ray+T-1與X-ray組相比細(xì)胞活力明顯升高(P<0.05)。

2.2T-1對(duì)X射線處理后細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響如圖1B及1C所示，Control組和T-1組未見明顯差異，X-ray組細(xì)胞內(nèi)活性氧水平顯著升高。X-ray+T-1與X-ray組相比細(xì)胞活性氧水平明顯降低(P<0.05)。

圖1丹參酮I對(duì)正常人膀胱上皮細(xì)胞的作用

A：各組細(xì)胞活力變化；B：各組細(xì)胞平均吸光度對(duì)比;C：各組細(xì)胞內(nèi)活性氧水平變化。

2.3T-1對(duì)細(xì)胞Nrf2-ARE信號(hào)通路的影響如圖2A及2B所示，T-I組總蛋白中Nrf2以及Nrf2信號(hào)通路中的蛋白NQO1、GPX2表達(dá)量高于對(duì)照組。X-ray+T-1組總蛋白中Nrf2、GCLC、NQO1、GPX2表達(dá)量高于X-ray組(P<0.05)。丹參酮I可以激活Nrf2-ARE信號(hào)通路，Nrf2以及下游蛋白表達(dá)量升高。

2.4T-1對(duì)X射線照射后小鼠膀胱黏膜早期損傷的影響根據(jù)黏膜厚度及黏膜層細(xì)胞結(jié)構(gòu)反映膀胱黏膜損傷程度。如圖3A及圖3C所示，在射線照射3 d后X-ray組以及X-ray+T-1組相較Control組和T-1組黏膜厚度增加，結(jié)構(gòu)紊亂。X-ray+T-1組黏膜厚度較X-ray組明顯降低(P<0.05)。如圖3B及圖3D所示，在射線照射7 d后X-ray組以及X-ray+T-1組黏膜厚度增加，結(jié)構(gòu)紊亂。X-ray+T-1組黏膜厚度較X-ray組明顯降低(P<0.05)。

2.5T-1對(duì)X射線照射后小鼠膀胱組織中SOD的影響如圖3E及3F所示，射線照射3 d及7 d后X-ray組SOD水平明顯下降，說(shuō)明射線處理后小鼠膀胱中氧化應(yīng)激水平較高。而X-ray+T-1與 X-ray組組相比SOD水平有明顯差異(P<0.05)。這說(shuō)明了丹參酮I預(yù)處理可以降低小鼠膀胱組織氧化應(yīng)激水平。

2.6T-1對(duì)小鼠膀胱組織Nrf2-ARE信號(hào)通路的影響見圖4。如圖4A及4B所示，射線處理3 d T-I組總蛋白中Nrf2、NQO1、GPX2、GCLC表達(dá)量高于Control組。X-ray+T-1組總蛋白中Nrf2、GCLC，NQO1，HMOX-1表達(dá)量明顯高于X-射線處理組(P<0.05)。如圖4C及4D所示，射線處理7 d T-I組總蛋白中Nrf2、NQO1、GPX2、GCLC、HMOX-1表達(dá)量高于Control組。X-ray+T-1組總蛋白中Nrf2、GCLC，NQO1，HMOX-1表達(dá)量明顯高于X-射線處理組(P<0.05)。丹參酮I可以激活Nrf2-ARE信號(hào)通路，Nrf2以及下游蛋白表達(dá)量升高。

圖2丹參酮I對(duì)細(xì)胞內(nèi)Nrf2-ARE信號(hào)通路蛋白的影響

A：各組細(xì)胞總蛋白內(nèi)Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白變化；

B：各組細(xì)胞蛋白表達(dá)量變化半自動(dòng)化定量分析結(jié)果。

圖3 丹參酮I對(duì)放射性膀胱炎早期黏膜增生及膀胱組織內(nèi)SOD的影響

A、B：不同組小鼠在射線處理后3 d(A)及7 d(B)膀胱內(nèi)黏膜厚度變化；C、D：不同組小鼠在射線處理后3 d(C)及7 d(D)膀胱內(nèi)黏膜厚度變化半自動(dòng)定量分析；E、F：不同組小鼠在射線處理后3 d(E)及7 d(F) 膀胱內(nèi)SOD活性變化。

圖4 丹參酮Ⅰ對(duì)小鼠膀胱Nrf2-ARE信號(hào)通路蛋白的影響

A、B：不同組小鼠在射線處理后3 d膀胱組織總蛋白內(nèi)Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白變化以及半自動(dòng)化定量分析；C、D：不同組小鼠在射線處理后7 d膀胱組織總蛋白內(nèi)Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白變化以及半自動(dòng)化定量分析。

3 討 論

在很多研究中已經(jīng)證明了抗氧化應(yīng)激對(duì)放射性膀胱炎有保護(hù)作用，同時(shí)丹參酮I擁有強(qiáng)大的抗氧化及抗炎能力。近期研究表明丹參酮I以及丹參酮IIA以及丹參酮在腎缺血再灌注損傷、神經(jīng)缺血再灌注損傷以及皮膚放射性損傷中有保護(hù)作用[17,23-24]。在我們此前的研究中也驗(yàn)證了丹參酮I對(duì)放射性膀胱炎的保護(hù)作用[15]。但是丹參酮I對(duì)放射性膀胱炎保護(hù)作用的分子機(jī)制尚未探索清楚。

核因子E2相關(guān)因子及抗氧化反應(yīng)原件信號(hào)通路Nrf2-ARE是近年來(lái)氧化應(yīng)激損傷與治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。Nrf2有一高度保守的堿性亮氨酸拉鏈(b Zip)結(jié)構(gòu)。正常情況下，Nrf2 和細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白 Keap1以N端的Neh2區(qū)域結(jié)合成二聚體的形式存在于細(xì)胞漿中，從而使保護(hù)細(xì)胞的酶類和抗氧化物處于基礎(chǔ)表達(dá)水平，細(xì)胞處于穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激損傷時(shí)，Nrf2與Keap1發(fā)生解離。Nrf2和Keap1解離后，Nrf2轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核并與ARE啟動(dòng)子部位結(jié)合，啟動(dòng)谷氨酰半胱氨酸連接酶(glutamate-cysteine ligase，GCLC)、醌氧化還原酶(quinone oxidoreductase，NQO1)、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HMOX-1)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶2(GPX2)等抗氧化基因的表達(dá)，達(dá)到防御氧化應(yīng)激損傷的目的。我們的研究表明 Nrf2-ARE 信號(hào)通路是在放射性膀胱損傷中起到重要作用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外和體內(nèi)兩部分證明T-1對(duì)放射性膀胱炎有保護(hù)作用，Nrf2-ARE 信號(hào)通路的激活在其中可能產(chǎn)生重要作用。在體外實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)X-ray+T-1組比X-ray組中細(xì)胞產(chǎn)生的 ROS 明顯減少，并且細(xì)胞活力明顯升高。因此我們確定T-1可以作用于人膀胱上皮細(xì)胞。T-1處理組總蛋白中Nrf2有不同程度的升高，同時(shí)Nrf2-ARE信號(hào)通路中的多種抗氧化酶(如GCLC、NQO1、HMOX1、GPX2)表達(dá)量隨之一同升高。因此證明丹參酮I可以激活Nrf2-ARE信號(hào)通路，可能在正常膀胱上皮細(xì)胞對(duì)抗X射線損傷中起重要作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)在T-1可以緩解器官內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)和急性期膀胱黏膜損傷。由于本課題組長(zhǎng)期從事放射性損傷的基礎(chǔ)研究，放射性膀胱炎模型的建立較為成熟，在前期工作中80%以上的小鼠在接受20 Gy的盆腔局部照射后膀胱會(huì)出現(xiàn)放射性膀胱損傷典型的組織形態(tài)學(xué)改變，因此本實(shí)驗(yàn)選取20 Gy射線劑量進(jìn)行造模[15,19,25]。射線處理3 d以及7 d后，將T-1處理組與Control組以及X-ray+T-1組與X-ray組進(jìn)行對(duì)比，我們發(fā)現(xiàn)T-1組和X-ray+T-1總蛋白中Nrf2以及信號(hào)通路中的多種抗氧化酶有不同程度的升高，結(jié)果表明丹參酮I可以激活Nrf2-ARE信號(hào)通路，可能在緩解小鼠膀胱組織X射線急性損傷中起重要作用。在丹參酮緩解紫外線引起的皮膚損傷以及砷引起的肺損傷的相關(guān)研究中，有研究者提出丹參酮I可能通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路阻抑組織損傷形成的假設(shè)，他們最終的研究結(jié)果與我們的結(jié)果相似[16-17]。但是本次實(shí)驗(yàn)仍有以下兩點(diǎn)不足：首先抗氧化應(yīng)激作用的信號(hào)通路不僅僅只有一個(gè)，不能排除T-1同時(shí)通過(guò)其他信號(hào)通路對(duì)放射性膀胱炎起到保護(hù)作用；其次我們的實(shí)驗(yàn)尚不能完全證明T-1直接激活Nrf2，需要構(gòu)建Nrf2沉默及過(guò)表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)質(zhì)粒從而在細(xì)胞模型中進(jìn)一步驗(yàn)證T-1對(duì)Nrf2-ARE信號(hào)通路的影響，同時(shí)需進(jìn)一步探索T-1在Nrf2缺陷小鼠中能否起保護(hù)作用。

總而言之，我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了丹參酮I通過(guò)激活Nrf2-ARE信號(hào)通路在放射性膀胱炎早期產(chǎn)生保護(hù)作用，為進(jìn)一步闡明丹參酮I治療放射性膀胱炎的可能機(jī)制提供了理論依據(jù)。我們?nèi)孕柽M(jìn)一步研究丹參酮I的作用機(jī)制，以推動(dòng)其在放射性膀胱炎中的臨床應(yīng)用，拓展祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在臨床難治性疾病中的應(yīng)用。