楊 森, 祝海娟, 杜洪銳, 陳瑞雪, 黨悅嘉, 周瑩瑩, 張艷菊*

(1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 哈爾濱 150030,2. 哈爾濱市阿城區(qū)種子服務(wù)中心, 哈爾濱 150030)

植物在逆境脅迫環(huán)境下,一些基因被誘導(dǎo)表達(dá),實(shí)現(xiàn)植物在蛋白組學(xué)水平的適應(yīng)性調(diào)整,構(gòu)建了植物整個(gè)復(fù)雜且高效的響應(yīng)系統(tǒng)。大量研究表明,病程相關(guān)蛋白(pathogenesis related protein)是主要的宿主功能蛋白,這些重要的功能蛋白在不同類型互作系統(tǒng)中得到了充分的驗(yàn)證,明確了各種類型植物防御機(jī)制相關(guān)功能性蛋白的作用[1-3]。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)構(gòu)建植物宿主-病原菌互作體系已經(jīng)成為當(dāng)前研究的趨勢(shì)和熱點(diǎn)之一。

由無(wú)性型真菌鐮孢屬尖鐮孢黃瓜?；虵usariumoxysporumf.sp.cucumerinum侵染引起的黃瓜枯萎病是黃瓜生產(chǎn)中的重要土傳病害,由于保護(hù)地的特殊環(huán)境條件和長(zhǎng)期連作,土壤中病原菌的積累量越來(lái)越多,導(dǎo)致黃瓜枯萎病等土傳病害發(fā)生逐年加重。F.oxysporum通常定殖于植物的維管束,對(duì)輸導(dǎo)組織產(chǎn)生危害,同時(shí)產(chǎn)生相應(yīng)的毒素,致使莖基部維管束變褐,嚴(yán)重地影響了水、礦物質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)的運(yùn)輸及黃瓜的生長(zhǎng)[4]。植物莖部除了運(yùn)輸水、礦物鹽、營(yíng)養(yǎng)和代謝物外,也參與長(zhǎng)距離信號(hào)運(yùn)輸,作為對(duì)病原菌、共生體和環(huán)境壓力入侵的一種反應(yīng)場(chǎng)所[5]。當(dāng)病原菌侵染植物時(shí),會(huì)有病程相關(guān)蛋白及其產(chǎn)物等一系列抗性相關(guān)物質(zhì)產(chǎn)生,其中包括代謝酶、與壓力有關(guān)的蛋白質(zhì)等。

本研究采用雙向電泳技術(shù)分析在兩種毒力不同的尖鐮孢脅迫下黃瓜抗感枯萎病品系莖中蛋白質(zhì)的差異表達(dá),用質(zhì)譜分析方法鑒定與抗病相關(guān)的蛋白質(zhì),從蛋白水平初步探索抗枯萎病機(jī)制,從而為維管束病害中寄主與病原的互作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃瓜枯萎病高抗品系‘D0327’和感病品系‘649’,由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黃瓜課題組提供。尖鐮孢黃瓜?；虵usariumoxysporumf.sp.cucumerinum強(qiáng)毒力菌株C9和弱毒力菌株S1,由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理研究室提供[6]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 接種

將培養(yǎng)在PSA平板上的供試菌種移入PL培養(yǎng)液中,置于25～28℃,轉(zhuǎn)速110～120 r/min的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)7～10 d。將菌液用4層紗布濾掉菌絲體,濾液在轉(zhuǎn)速4 000 r/min下離心10 min后移去上清液,加入無(wú)菌蒸餾水配制成1.0×107個(gè)/mL的孢子懸浮液。于黃瓜幼苗兩片真葉期,采用灌根法將2個(gè)毒力不同的尖鐮孢菌株分別接種抗感黃瓜品系[7]。接種后待感病品系‘649’莖部出現(xiàn)變黃癥狀后(7 d)進(jìn)行取材,將整株莖剪成5 cm莖段用錫紙包好,迅速用液氮處理后置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 黃瓜莖部蛋白質(zhì)的提取

利用TCA-丙酮法[8],提取黃瓜莖組織蛋白質(zhì)。利用考馬斯亮藍(lán)法[9]測(cè)定蛋白質(zhì)濃度并進(jìn)行定量。稱取1 g黃瓜莖放入預(yù)冷的研缽中,加入液氮研磨至粉末狀;將粉末轉(zhuǎn)移至2 mL EP管中,加入5倍體積預(yù)冷的10%TCA-丙酮溶液,漩渦振蕩至其混合充分,放于-20℃冰箱沉淀過(guò)夜; 4℃,13 000 r/min離心30 min,移去上清液;向沉淀中加入5倍體積預(yù)冷的丙酮溶液(含0.07%β-巰基乙醇,-20℃預(yù)冷),充分混合,置于-20℃冰箱中靜置1 h(期間漩渦振蕩幾次); 4℃,13 000 r/min離心30 min,移去上清液(重復(fù)上述步驟6～7次,洗至上清呈無(wú)色);沉淀經(jīng)真空干燥制成蛋白質(zhì)干粉,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 蛋白質(zhì)雙向電泳

第一向電泳選擇24 cm,pH 4～7的IPG膠條進(jìn)行等電聚焦,第二向電泳采用12.5%的SDS-PAGE分離膠,雙向電泳結(jié)束后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)G-250染色,每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)。獲得的2-DE凝膠圖像通過(guò)Imagemaster 2D Platinum 7.0軟件進(jìn)行圖像分析。與參考膠比較,特異表達(dá)、表達(dá)量上調(diào)或下調(diào)2倍以上被認(rèn)為是差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。

1.2.4 質(zhì)譜鑒定和蛋白鑒定

委托哈爾濱賽信生物科技有限公司進(jìn)行MALDI-TOF-TOF/MS質(zhì)譜分析。質(zhì)譜分析結(jié)果利用軟件Mascot 2.3.02進(jìn)行分析,經(jīng)過(guò)NCBI(nr)數(shù)據(jù)庫(kù)和黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/genome/index.cgi?organism=cucumber)分析,獲得相關(guān)蛋白質(zhì)點(diǎn)的鑒定結(jié)果。

1.2.5 差異蛋白基因表達(dá)驗(yàn)證

在黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索編碼蛋白的基因,利用在線工具GenScript Real-time PCR (TaqMan) Primer Design進(jìn)行設(shè)計(jì)(https:∥www.genscript.com/ssl-bin/app/primer)。引物序列發(fā)送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行合成,引物序列見(jiàn)表1。

表1qRT-PCR引物序列

Table1PrimersequencesforqRT-PCR

基因編號(hào)Gene no.引物序列(5'-3')Sequence of primerCsEF1αF:CGCTCTTCTTGCTTTCACCCTTR:TACCTTGCCTTGGAGTATTTGGCsa5M611600.1F:GCAACACTTGGCCGTATCATR:AATTTGCTGTTCCGTTGCCTCsa6M484600.2F:CACCATCGGAGCTGAGAGATR:CTCATCCTGTCTGCAATGCCCsa4M063440.1F:TACAGCGTCCAACGTGAATGR:CCCTCCACAAACTTCCTTGCCsa6M450370.1F:TGGTGCAAATGCCATACTCGR:TGCAAGCTTGTTTCCTGCATCsa4M598000.1F:TGGAACAAACGAGGAGGTGAR:CCAGTAAACGCACCACCTTTCsa3M116710.1F:TGGACTCTGATGTGGGAACCR:GTAAACGGGACCTTCTGGGACsa017651F:GGGTGATCTATATGGAAAGCTGGAR:TTCATGTAGGTCGACACCGTCsa6M522690.1F:CCTCTGCAATGGCTCTTTCCR:CTGACTTGCTGGCAGTCTTC

采用TRIzol法提取黃瓜葉片總RNA[10]。根據(jù)Toyobo反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace qPCR RT-Kit說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA。依照SYBR?Green Realtime PCR Master Mix說(shuō)明書進(jìn)行。參照基因?yàn)镃sEF1α(GenBank Accession Number: XM_004138916)[11]。反應(yīng)體系SYBR Green PCR Master Mix, 10 μL; 上游引物0.5 μL; 下游引物0.5 μL; cDNA 2 μL; ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件:95℃ 3 min;95℃ 10 s,58℃ 20 s,72℃ 30 s,40次循環(huán);55℃ 10 s,81次循環(huán);4℃,10 min。采用2-ΔΔCT相對(duì)定量分析方法計(jì)算出基因的相對(duì)表達(dá)量[12],并用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件進(jìn)行方差及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 尖鐮孢脅迫下不同抗性黃瓜品系莖組織蛋白雙向電泳圖譜分析

2.1.1 C9脅迫下黃瓜抗、感品系蛋白雙向電泳圖譜

利用Imagemaster 2D Platinum 7.0圖像軟件分析,并對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行篩選,最終確定C9脅迫下感病品系中共有6個(gè)符合2倍以上并且有99%統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異的蛋白質(zhì)點(diǎn),抗病品系中共有3個(gè)差異蛋白點(diǎn)(見(jiàn)圖1)。

圖1 C9脅迫下黃瓜抗、感品系莖部蛋白的雙向電泳圖Fig.1 The 2-DE map of differential protein spots in susceptible and resistant cucumber lines under the stress of C9

2.1.2 S1脅迫下黃瓜抗、感品系蛋白雙向電泳圖譜

S1脅迫下感病品系中共有4個(gè)符合2倍以上并且有99%統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異的蛋白質(zhì)點(diǎn),抗病品種中共有5個(gè)差異蛋白點(diǎn)(見(jiàn)圖2)。從雙向電泳圖譜可以看出,無(wú)論感病還是抗病品系,S1脅迫下出現(xiàn)的差異蛋白點(diǎn)大都集中在對(duì)照。

圖2 S1脅迫下黃瓜抗、感品系莖部蛋白的雙向電泳圖Fig.2 The 2-DE map of differential protein spots in susceptible and resistant cucumber lines under the stress of S1

點(diǎn)號(hào)Spot no.基因編號(hào)Gene no.分子量/DaMW等電點(diǎn)pI序列覆蓋率/%Sequence coverage得分Score蛋白名稱Protein name表達(dá)模式Expression pattern1Csa5M611600.159 885.25.9036470Enolase上調(diào)2Csa6M484600.241 911.05.31721 100Actin上調(diào)3Csa4M063440.128 292.37.6144557Oxygen-evolving enhancer protein下調(diào)4Csa6M450370.147 942.55.4861752Enolase isoform X1上調(diào)5Csa4M598000.127 502.35.6165784Triosephosphate isomerase上調(diào)6Csa3M116710.116 450.56.3073657Nucleoside diphosphate kinase上調(diào)7Csa01765118 010.95.1544233Csf-2 protein下調(diào)8Csa6M522690.128 239.15.1430258Chlorophyll a-b binding protein of LHCII type I上調(diào)

2.2 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定

通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè),獲得質(zhì)譜圖譜,8個(gè)PMF出峰情況良好,根據(jù)NCBI黃瓜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到8個(gè)陽(yáng)性結(jié)果。通過(guò)對(duì)兩種尖鐮孢處理后的抗感黃瓜品系進(jìn)行分析,最終成功鑒定出8個(gè)差異蛋白點(diǎn),其中6個(gè)差異蛋白上調(diào)表達(dá),2個(gè)下調(diào)表達(dá),如表2。差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜結(jié)果如下。

強(qiáng)毒力菌株C9脅迫下,感病品系中鑒定出3個(gè)差異蛋白點(diǎn),分別是1、2和3號(hào),抗病品系中差異蛋白為4、5及6號(hào)。弱毒力菌株S1脅迫下,感病品系中差異蛋白為7號(hào),抗病品系中差異蛋白為8號(hào)。

1和4號(hào)為烯醇化酶及其亞基。在糖酵解中烯醇化酶及其亞基主要參與2-磷酸-D-甘油酸與磷酸烯醇式丙酮酸之間進(jìn)行相互轉(zhuǎn)化。

2號(hào)蛋白點(diǎn)為肌動(dòng)蛋白。肌動(dòng)蛋白是構(gòu)成真核生物細(xì)胞骨架的重要成分,它參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng),以及多種細(xì)胞內(nèi)過(guò)程,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、分化、細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸、細(xì)胞壁的生物合成、共生現(xiàn)象、胞吞胞吐作用以及膜的循環(huán)利用等方面具有較好的控制作用[13]。

3號(hào)和8號(hào)蛋白點(diǎn)分別為放氧增強(qiáng)蛋白OEE (oxygen-evolving enhancer protein)和捕光復(fù)合體I型葉綠素a/b 結(jié)合蛋白(LHCII type I chlorophyll a/b-binding protein)。這2個(gè)蛋白均與植物光合作用有關(guān),8號(hào)蛋白參與光合作用原初反應(yīng)的蛋白質(zhì),主要功能進(jìn)行捕獲葉綠素,相關(guān)研究指出葉綠素的含量與植物的抗病性呈正相關(guān),葉綠素含量升高,植株的抗病性增強(qiáng)。

5號(hào)蛋白點(diǎn)為磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)。磷酸丙糖異構(gòu)酶在生物體內(nèi)的功能主要是參與糖酵解,是糖酵解途徑中的主要蛋白酶。TPI催化磷酸丙糖異構(gòu)體在二羥丙酮磷酸和D-甘油醛-3-磷酸之間的可逆轉(zhuǎn)化,是糖酵解中不可或缺的酶。

6號(hào)蛋白點(diǎn)為核苷酸二磷酸激酶(NDPK/NDK)。在生物體內(nèi)核苷酸二磷酸激酶催化磷酸基團(tuán)在ATP和NDP兩者之間進(jìn)行可逆的轉(zhuǎn)移,用以維持ATP和NTP兩者濃度在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定。

7號(hào)蛋白點(diǎn)為Csf-2蛋白。該蛋白是一種分泌蛋白,其主要功能與植物防御反應(yīng)相關(guān),參與應(yīng)答生物刺激,但具體作用機(jī)理尚未清楚。

2.3 差異蛋白基因表達(dá)驗(yàn)證

通過(guò)qRT-PCR對(duì)差異蛋白基因的表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果如圖3所示。8個(gè)差異蛋白基因的表達(dá)模式均與其蛋白表達(dá)相一致,說(shuō)明差異蛋白是由基因差異表達(dá)引起的。

圖3 差異蛋白基因相對(duì)表達(dá)量 Table 3 Relative expression of differential protein genes

3 討論

蛋白質(zhì)是生命最直接的體現(xiàn),在生理及病理?xiàng)l件的改變下,生物體的蛋白會(huì)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)及功能的變化[14]。植物在被病原物侵染刺激后,其本身會(huì)產(chǎn)生一系列的防御反應(yīng),尤其是一些病程相關(guān)蛋白的表達(dá)會(huì)有一定的變化[15-16]。本研究采用雙向電泳技術(shù)分析在兩種毒力不同的尖鐮孢脅迫下黃瓜抗、感枯萎病品系莖中蛋白質(zhì)的差異表達(dá),共鑒定出8個(gè)差異蛋白。根據(jù)其功能不同,將8個(gè)蛋白分為能量代謝相關(guān)蛋白、光合作用相關(guān)蛋白和脅迫反應(yīng)相關(guān)蛋白。

能量代謝相關(guān)蛋白為1、4、5、6號(hào),1、4號(hào)蛋白為烯醇化酶及其亞基,5號(hào)蛋白為磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI),6號(hào)蛋白為核苷酸二磷酸激酶(NDPK/NDK),這4種參與能量生成的蛋白質(zhì)在本研究中均出現(xiàn)上調(diào)表達(dá),且3種在抗病品系出現(xiàn),說(shuō)明在同一菌株脅迫下抗感品系表現(xiàn)出一定的差異性,對(duì)外界不良環(huán)境表現(xiàn)出一定的抗性。這4種與能量相關(guān)的蛋白均在高毒力菌株C9的脅迫下差異表達(dá),說(shuō)明毒力高的菌種可更好地激活植物組織相關(guān)蛋白的表達(dá),進(jìn)而提高抗病性。

光合作用相關(guān)蛋白為3、8號(hào),3號(hào)蛋白為放氧增強(qiáng)蛋白OEE (oxygen-evolving enhancer protein),8號(hào)蛋白為捕光復(fù)合體I型葉綠素a/b 結(jié)合蛋白(LHCII type I chlorophyll a/b-binding protein)。葉綠素含量與植物抗病性正相關(guān)[17],8號(hào)是參與光合作用原初反應(yīng)的蛋白質(zhì),與植物葉綠素含量相關(guān),很可能參與黃瓜抗枯萎病的反應(yīng)。S1菌株脅迫下,8號(hào)蛋白在抗病品系中上調(diào)表達(dá),而C9菌株脅迫下,3號(hào)蛋白在感病品系中下調(diào)表達(dá),說(shuō)明在毒力不同的菌株誘導(dǎo)下蛋白表達(dá)存在差異。

脅迫反應(yīng)相關(guān)蛋白為2號(hào),肌動(dòng)蛋白。該蛋白在高毒力菌株侵染感病品系中上調(diào)表達(dá)。肌動(dòng)蛋白普遍存在真核生物中,在細(xì)胞外表組織形態(tài)的維持、正常生長(zhǎng)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等中具有重要意義[9,18]。

通過(guò)本試驗(yàn)可以看出在病原菌脅迫下,為適應(yīng)外界環(huán)境的變化,植物體內(nèi)迅速做出反應(yīng),尤其是在毒力強(qiáng)的菌株脅迫下表現(xiàn)得更為明顯。通過(guò)分析上述試驗(yàn)結(jié)果,說(shuō)明參與物質(zhì)和能量代謝的蛋白與黃瓜抗枯萎病相關(guān)。本研究初步探討了黃瓜枯萎病菌誘導(dǎo)黃瓜的抗性應(yīng)答機(jī)理,為進(jìn)一步篩選抗性相關(guān)特異蛋白質(zhì)作為標(biāo)記性狀選育新的抗性黃瓜品種奠定理論基礎(chǔ)。