張 林， 高 敏， 倪紅梅， 方榮俊， 潘 剛， 趙衛(wèi)國， 劉 利

(1.江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212018； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，江蘇鎮(zhèn)江 212018)

桑樹(MorusalbaL.)為?？?Moraceae)桑屬(MorusL.)落葉喬木或灌木，原產(chǎn)中國中部和北部，葉為桑蠶飼料，桑樹品種、桑葉產(chǎn)量及葉質(zhì)是養(yǎng)蠶的決定性因素。因此作為蠶業(yè)生產(chǎn)基礎(chǔ)資料的桑樹品種，其經(jīng)濟性狀的改良對促進蠶業(yè)發(fā)展有著巨大的作用。不斷提高桑樹品種的產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病性和適應(yīng)性是現(xiàn)代桑樹育種家追求的主要目標(biāo)[1]。但是桑樹的多數(shù)經(jīng)濟性狀與農(nóng)藝性狀，例如產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆性、抗病性等都是數(shù)量性狀。與質(zhì)量性狀的遺傳特性不同，數(shù)量性狀受多基因的數(shù)量性狀位點控制，遺傳基礎(chǔ)比較復(fù)雜，而且容易被環(huán)境因素影響，且呈連續(xù)性變異，表現(xiàn)型與基因型的對應(yīng)關(guān)系也不明確，對其遺傳基礎(chǔ)的研究比較困難[2]，了解和研究這些數(shù)量性狀的遺傳規(guī)律對農(nóng)作物的遺傳改良具有重要意義。

本研究擬采用以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的ISSR技術(shù)探討供試材料的遺傳多樣性。ISSR技術(shù)具有遺傳多態(tài)性高、重復(fù)性好、使用范圍廣、操作簡單、試驗成本低等優(yōu)點，ISSR技術(shù)因其簡便快速、穩(wěn)定可靠的特性已在一些農(nóng)作物和經(jīng)濟作物的遺傳性研究上獲得了廣泛的應(yīng)用并取得了理想的結(jié)果，該技術(shù)在研究桑樹種質(zhì)資源的品種鑒定和親緣關(guān)系分析、群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性研究方面也是一種行之有效的工具。Prevost等采用4個ISSR引物對34個馬鈴薯品種進行分析研究，并將這34個品種區(qū)別開來[3]。Vijayan等用17個ISSR引物對印度桑屬野生品種進行了遺傳多樣性分析[4]。

關(guān)聯(lián)分析是建立在連鎖不平衡的基礎(chǔ)上，能夠識別群體內(nèi)目標(biāo)性狀與候選基因或遺傳標(biāo)記之間的關(guān)系，從而鑒定群體內(nèi)目標(biāo)性狀與遺傳標(biāo)記或候選基因關(guān)系的分析方法[5]。該方法近期開始在植物數(shù)量性狀研究和植物育種中應(yīng)用，其利用的是自然變異，不需要花費過多的時間和精力去構(gòu)建作圖群體，可以廣泛地檢測遺傳變異，具有較高的分辨率[1]。本研究擬對我國桑樹地方品種及創(chuàng)新桑種質(zhì)的性狀進行關(guān)聯(lián)分析，從而尋找與其表型相關(guān)的優(yōu)異基因，從分子水平解釋桑樹表型性狀的遺傳變異規(guī)律，進而為桑樹數(shù)量性狀遺傳改良研究提供理論基礎(chǔ)，為桑樹雜交育種尋求新途徑。Thornsberry首次將關(guān)聯(lián)分析引入到植物復(fù)雜性狀研究中，發(fā)現(xiàn)了與玉米花期性狀呈顯著性相關(guān)的Dwarf8基因序列的多態(tài)性[6]，被廣泛應(yīng)用于擬南芥[7]、水稻[8]和大豆[9]等作物中?？傊P(guān)聯(lián)分析將成為研究植物數(shù)量性狀的強有力工具，為更深刻地認識和了解植物數(shù)量性狀的遺傳規(guī)律及品種的遺傳改良提供了新的方法和途徑。本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對黃河流域魯桑、太湖流域湖桑2種類型共96份桑樹品種的21個農(nóng)藝性狀進行調(diào)查研究，并利用10個ISSR標(biāo)記的多態(tài)性對供試材料進行遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析，從而分析遺傳標(biāo)記與表型性狀的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為取自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所江蘇鎮(zhèn)江國家桑樹種質(zhì)資源圃的96份桑樹種質(zhì)，其中包括34份黃河下游魯桑桑樹種質(zhì)和62份太湖流域湖桑桑樹種質(zhì)，供試的96份桑樹試驗材料的來源見表1。

1.2 桑樹種質(zhì)資源農(nóng)藝性狀的鑒定

在國家種質(zhì)江蘇鎮(zhèn)江桑樹圃對桑樹種質(zhì)農(nóng)藝性狀進行田間調(diào)查，依據(jù)《桑樹種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[10]的要求確定取樣方法和調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)，參照本課題組桑樹農(nóng)藝性狀的數(shù)據(jù)庫，計算出每份桑樹種質(zhì)資源的所有農(nóng)藝性狀的平均值、變異系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，并進行方差檢驗分析，判斷試驗結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性。取平均值作為該種質(zhì)的最終性狀值，最后統(tǒng)計并分析各個性狀的平均值。

表1 桑樹種質(zhì)資源材料的來源

續(xù)表1

編號品種來源桑種55甩桑2號浙江省新昌縣湖桑56胡桃桑浙江省肖山縣湖桑57彎條桑浙江省湖州市湖桑58湖桑3號江蘇省無錫市湖桑59湖桑5號浙江省杭州市湖桑60湖桑6號浙江省杭州市湖桑61湖桑10號江蘇省無錫市湖桑62湖桑20號江蘇省無錫市湖桑63湖桑21號江蘇省無錫市湖桑64湖桑24號江蘇省無錫市湖桑65湖桑26號江蘇省無錫市湖桑66湖桑31號江蘇省無錫市湖桑67溧陽紅皮江蘇省南京市湖桑68新橋青桑浙江省富陽市湖桑69湖桑36號江蘇省無錫市湖桑70湖桑37號江蘇省無錫市湖桑71湖桑38號江蘇省無錫市湖桑72湖桑39號江蘇省無錫市湖桑73湖實雞冠江蘇省無錫市湖桑74梅村1號江蘇省無錫市湖桑75湖桑60號江蘇省無錫市湖桑76無錫短節(jié)湖江蘇省無錫市湖桑77湖桑86號浙江省杭州市湖桑78鎮(zhèn)荷桑浙江省湖州市湖桑79洞庭1號江蘇省蘇州市湖桑80富陽青浙江省富陽市湖桑81富陽桑浙江省富陽市湖桑82石門青浙江省桐鄉(xiāng)市湖桑83早青桑浙江省德清縣湖桑84璜桑3號浙江省諸暨市湖桑85璜桑14號浙江省諸暨市湖桑86海鹽面青浙江省海鹽縣湖桑87大種桑浙江省富陽市湖桑88海桑浙江省鄞縣 湖桑89白色青浙江省海寧市湖桑90望海桑浙江省嵊縣 湖桑91菱湖大種浙江省湖州市湖桑92璜桑8號浙江省諸暨市湖桑93白皮大種浙江省湖州市湖桑94豬肚桑浙江省嵊縣 湖桑95吳興大種浙江省湖州市湖桑96剪刀桑浙江省嵊縣 湖桑

1.3 ISSR引物的選取與擴增

選取加拿大哥倫比亞大學(xué)的設(shè)計并參考趙衛(wèi)國博士論文中部分引物[11]進行多態(tài)性篩選，初步選定了22個引物用于ISSR分子標(biāo)記，引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。桑樹總DNA的提取擬采用植物基因組提取試劑盒法，PCR程序為94 ℃ 7 min；94 ℃ 40 s，退火45s(根據(jù)Tm值而定)，72 ℃ 90 s，36個循環(huán)；72 ℃ 7 min；4 ℃保存。ISSR-PCR電泳并照相記錄后，進行人工讀帶。同一引物的擴增產(chǎn)物中，分子量大小及強度相近的條帶被認為具同源性，屬于同一位點的產(chǎn)物。讀帶時要遵循排除模糊不清的條帶、只記錄清晰且易于辨認的條帶的原則。對于分子量大小相同但強度不同的條帶，當(dāng)強帶的強度大于弱帶的2倍時，則將它們讀為不同的條帶。

1.4 群體結(jié)構(gòu)分析

利用Structure 2.3.4軟件對供試材料進行基于貝葉斯數(shù)學(xué)模型的聚類分析，從而估算其群體結(jié)構(gòu)關(guān)系。計算材料相應(yīng)的遺傳成分系數(shù)(Q)：當(dāng)某材料在某個類群中的Q值≥0.5時，該品種將被劃分到相應(yīng)的類群中，認為該品種的血緣相對比較單一；若某材料在任何類群中的Q值均 <0.5 時，則認為該品種擁有混合來源[12-15]。按照以上方法將群體中各材料劃分至對應(yīng)的亞群并繪制群體結(jié)構(gòu)圖。

1.5 親緣關(guān)系系數(shù)分析

親緣關(guān)系系數(shù)(Kinship)是衡量品種間親緣相似性的參數(shù)，本研究采用SPAGeDi軟件計算96份桑樹種質(zhì)個體間的親緣關(guān)系，得到親緣關(guān)系系數(shù)矩陣(K矩陣)。親緣關(guān)系是2個材料個體間的遺傳相似度與任意材料個體間遺傳相似度的相對值，因此當(dāng)Kinship值<0時，表明某2個材料品種間的親緣關(guān)系低于群體中任意2個材料品種的親緣關(guān)系，則直接定義此值為0，所有系數(shù)加倍[16-17]。

1.6 標(biāo)記和農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析

結(jié)合TASSEL 2.1軟件中的MLM模型[17]，分析性狀與標(biāo)記位點之間的關(guān)聯(lián)性，并計算標(biāo)記位點對表型變異的貢獻率(即解釋率)。綜合96份桑樹材料各農(nóng)藝性狀的表型數(shù)據(jù)和標(biāo)記位點的多態(tài)性數(shù)據(jù)，以群體結(jié)構(gòu)的Q值作為協(xié)變量，將96份供試材料的親緣關(guān)系K矩陣連同21個農(nóng)藝性狀表型數(shù)據(jù)，對93個多態(tài)性標(biāo)記位點進行標(biāo)記和性狀間的關(guān)聯(lián)分析[17]。所得結(jié)果中當(dāng)P<0.01時，則認為該標(biāo)記與相應(yīng)性狀之間存在極顯著的關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑樹地方品種的主要農(nóng)藝性狀

從表2可見，這21個農(nóng)藝性狀變異幅度存在較大差異，其中變異系數(shù)在30%以上的性狀為生長芽率、春米條葉、秋公斤數(shù)、梢梗葉、椹梗葉、葉梗葉和株產(chǎn)葉量，梢梗葉、椹梗葉和葉梗葉的變異系數(shù)甚至達到了50%以上。椹梗葉的變異系數(shù)最大，為 180.99%，秋萬頭繭量的變異系數(shù)最小，為9.32%。結(jié)果表明，供試桑樹種質(zhì)資源品種間的各性狀存在較大差異，多樣性比較豐富，可為桑樹育種提供豐富的親本材料。

表2 96份供試材料21個農(nóng)藝性狀的基本描述性統(tǒng)計

2.2 遺傳多樣性統(tǒng)計分析與聚類分析

通過篩選，從22個引物中選出的多態(tài)性強、條帶清晰、結(jié)果穩(wěn)定且重復(fù)性好的10個引物被用于桑樹地方品種的ISSR分子標(biāo)記多態(tài)性分析。10個ISSR引物通過PCR反應(yīng)共擴增出93條清晰的帶，其中73條帶具有多態(tài)性，多態(tài)性條帶百分率為78.49%，平均每個引物擴增的條帶數(shù)為9.3條，平均每個引物擴增的多態(tài)性條帶數(shù)為7.3條。不同引物的擴增帶數(shù)從7到11不等。平均每個位點觀測等位基因數(shù)為1.795 7，有效等位基因數(shù)為1.496 4，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)為 0.286 9，Shannon’s信息指數(shù)為0.426 8，表明96份供試材料之間的ISSR變異大，多態(tài)性高。

2.3 品種聚類分析

利用73個多態(tài)性位點數(shù)據(jù)，96個品種被聚為2類(圖1)，Ⅰ類34份材料均為魯桑品種，來自山東省的7個品種親緣關(guān)系較近，被聚為一類，Ⅱ類為62份湖桑品種，湖桑和魯桑親緣關(guān)系較遠。

2.4 群體結(jié)構(gòu)分析

通過采用基于貝葉斯的聚類分析方法分析供試材料的遺傳結(jié)構(gòu)，從而確定其群體數(shù)目。利用Structure 2.3.4軟件評估群體的K值，即亞群數(shù)(范圍設(shè)為2～10)，依據(jù)運算的輸出結(jié)果，K與ΔK的關(guān)系如圖2所示。當(dāng)K=2時，模型中的ΔK出現(xiàn)峰值。因此根據(jù)分析結(jié)果可將參試的96份桑樹種質(zhì)劃分為2個亞群，群體結(jié)構(gòu)聚類結(jié)果見圖3。各個品種在不同亞群中的Q值如表3所示，當(dāng)Q<0.5時，亞群1含有的34份桑樹材料全部為黃河下游魯桑桑樹種質(zhì)，亞群2的62份供試材料為太湖流域湖桑桑樹種質(zhì)。96份樣本的劃分與UPGMA聚類分析的結(jié)果完全一致，這也體現(xiàn)了Structure軟件對群體結(jié)構(gòu)進行聚類分析的準(zhǔn)確性。

2.5 群體親緣關(guān)系分析

結(jié)合93個ISSR標(biāo)記位點，利用SPAGeDi軟件對96份供試材料進行親緣關(guān)系分析，品種間的平均親緣關(guān)系Kinship值為0.111 3，其中52.11%的材料間的Kinship值為0，約39.63%的材料Kinship值在0～0.2之間，Kinship值小于0.5的情況達到了總數(shù)的96.18%，親緣關(guān)系在0.5以上的情況只占到了3.82%(圖4)。這說明96份地方桑樹品種間的親緣關(guān)系較弱，極少數(shù)的品種之間有較近的親緣關(guān)系，表明參試品種之間存在著豐富的遺傳變異和廣泛的代表性。

表3 96份桑樹材料在2個亞群中的Q值

2.6 標(biāo)記與農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析

通過TASSEL 2.1軟件的MLM模型，把Structure軟件計算出的群體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)(Q值)作為協(xié)變量，將96份供試材料的親緣關(guān)系K矩陣連同葉長、葉幅、節(jié)間距等農(nóng)藝性狀表型數(shù)據(jù)對93個多態(tài)性標(biāo)記位點進行標(biāo)記和性狀間的關(guān)聯(lián)分析。標(biāo)記位點對表型性狀的解釋率見表4。從表4可以看出，經(jīng)MLM混合線性模型檢測的93個位點中，與15個表型農(nóng)藝性狀(葉長、節(jié)間長、生長芽率、春米條葉、秋米條葉、春公斤數(shù)、秋公斤數(shù)、葉梗葉、梢梗葉、條梗葉、株產(chǎn)葉量、春萬頭繭量、春萬繭層量、春擔(dān)桑繭量、秋萬頭繭量)相關(guān)的標(biāo)記位點共有28個，變異解釋率為5.42%～16.35%。其中與葉長相關(guān)的位點有2個，表型變異的解釋率為11.58%和8.62%，解釋率最大的標(biāo)記為loci5。與節(jié)間長、生長芽率和秋萬頭繭量相關(guān)聯(lián)的位點各有3個，表型變異解釋率最大的標(biāo)記分別位于loci86(解釋率為10.87%)、loci72(解釋率為8.62%)和loci45(解釋率為10.20%)。與春米條葉、春萬頭繭量、春擔(dān)桑繭量相關(guān)聯(lián)的位點各有5個，各自的表型變異解釋率分別在7.73%～10.69%、6.41%～13.73%、6.00%～11.97%之間，解釋率最大的標(biāo)記分別為loci66、loci21和loci45。有2個標(biāo)記位點與秋米條葉相關(guān)聯(lián)，位點loci66的表型變異解釋率最大，為15.40%。春公斤數(shù)、條梗葉和株產(chǎn)葉量都有4個標(biāo)記位點與之相關(guān)聯(lián)，其中春公斤數(shù)的最大表型變異解釋率為loci70(解釋率為16.35%)，條梗葉和株產(chǎn)葉量都與loci64位點相關(guān)聯(lián)且二者的最大表型變異解釋率的標(biāo)記也為loci64。秋公斤數(shù)只有變異解釋率為9.17%的loci81位點與之相關(guān)聯(lián)，葉梗葉與6個標(biāo)記位點相關(guān)聯(lián)，最大變異解釋率為9.78%，位于loci59位點。與梢梗葉和春萬繭層量相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點各有7個，最大變異解釋率分別為13.92%和15.25%，位于位點loci90和位點loci21處。葉幅、發(fā)芽率等6個農(nóng)藝性狀未檢測出與其相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點。在28個標(biāo)記位點中有1個標(biāo)記位點同時與5個農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)，有4個位點同時與4個農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)，有4個標(biāo)記位點同時與3個農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)，有10個位點同時與2個農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)。

表4 與農(nóng)藝性狀極顯著關(guān)聯(lián)(P<0.01)的標(biāo)記位點及其對表型變異的解釋率

3 結(jié)論與討論

3.1 遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu)分析

本研究通過利用ISSR分子標(biāo)記對96份桑樹種質(zhì)資源進行遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明96份供試材料個體間存在著豐富的遺傳多樣性，同時基于遺傳系數(shù)的UPGMA聚類分析結(jié)果也顯示出了參試品種的遺傳多樣性。

在進行關(guān)聯(lián)分析時，一些本不關(guān)聯(lián)的等位基因會與一些目標(biāo)性狀之間存在著連鎖不平衡(linkae disequilibrium，LD)現(xiàn)象，即所謂的偽關(guān)聯(lián)或假 陽性現(xiàn)象。因此在進行關(guān)聯(lián)分析時必須評估群體結(jié)構(gòu)，了解群體內(nèi)供試材料的遺傳學(xué)相關(guān)信息，這樣才能盡量減少假陽性現(xiàn)象的出現(xiàn)，以保證關(guān)聯(lián)分析準(zhǔn)確有效地進行。利用Structure軟件對供試材料進行基于貝葉斯數(shù)學(xué)模型的群體結(jié)構(gòu)聚類分析，結(jié)果顯示96份樣本的劃分與UPGMA聚類分析的結(jié)果完全一致，更準(zhǔn)確地反映出了供試材料間的群體結(jié)構(gòu)。

3.2 表型農(nóng)藝性狀與分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析

關(guān)聯(lián)分析作為一種數(shù)量性狀分析方法，已在植物研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。為減少關(guān)聯(lián)分析過程中存在的假陽性現(xiàn)象，本研究采用MLM模型對96份供試材料進行混合線性分析，該模型能有效檢測出多態(tài)性標(biāo)記位點與性狀之間的關(guān)聯(lián)性，使關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果更精確。分析結(jié)果顯示參試的10個ISSR標(biāo)記共93個多態(tài)性位點中，在P<0.01的極顯著情況下，與葉長、節(jié)間距等15個農(nóng)藝性狀相關(guān)的標(biāo)記位點共有28個，變異解釋率為5.42%～16.35%，其中有1個標(biāo)記位點同時與5個農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)，有4個位點同時與4個農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)，有4個標(biāo)記位點同時與3個農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)，有10個位點同時與2個農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)，未檢測出與葉幅、發(fā)芽率等6個農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點。