林麗飛， 張 敏， 和 平， 羅巧育， 胡先奇

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)省部共建云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗室，云南昆明 650201；2.云南省農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗室/紅河學(xué)院，云南蒙自 661100)

植物根結(jié)線蟲病是由根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)引起的一種世界性病害，寄主超過3 000種，尤以茄科、葫蘆科、十字花科等植物受害嚴(yán)重，蔬菜根結(jié)線蟲病在我國南方、北方都能發(fā)生，且呈逐年加重趨勢[1]。尤其是南方根結(jié)線蟲，由于其寄主范圍廣、致病性強(qiáng)、繁殖速度快、易傳播擴(kuò)散等特性，目前已成為世界各地蔬菜種植區(qū)最重要的病原物類群之一[2]。在我國由于溫室連作現(xiàn)象較嚴(yán)重，致使許多老齡溫室南方根結(jié)線蟲病害的發(fā)生尤為嚴(yán)重，一般每年造成的經(jīng)濟(jì)損失為10%～15%，嚴(yán)重者損失可達(dá)30%～40%，甚至絕產(chǎn)[3]。土壤線蟲、土壤微生物及植物均與連作引起的植物根結(jié)線蟲病害有關(guān)，但關(guān)于三者之間相互關(guān)系的研究較少，更少見精胺對番茄連作病土與三者關(guān)系影響的研究報道。連作病土對連作番茄的危害現(xiàn)象普遍存在，但對連作番茄的危害程度及對土壤微生物與土壤線蟲的影響程度缺乏系統(tǒng)研究。

精胺(spermine，簡稱Spm)是一種內(nèi)源性物質(zhì)，廣泛存在于生物體內(nèi)，自20世紀(jì)60年代美國耶魯大學(xué)的學(xué)者提出多胺具有刺激生長和防止衰老的作用以來，越來越多的研究表明，多胺具有較強(qiáng)延緩植物葉片衰老的作用[4]。它不僅可以直接與活性氧(reactive oxygen species，簡稱ROS)反應(yīng)，還可以通過提高抗氧化酶活性參與脅迫條件下ROS的清除，增強(qiáng)植物抗逆性[5]。但有關(guān)精胺的研究和報道較少，尤其是其與南方根結(jié)線蟲的相互作用目前還未見報道。本試驗采用溫室盆栽人工接種法研究精胺代謝物對連作番茄南方根結(jié)線蟲病的抗性程度，重點(diǎn)考察精胺處理后的健康土壤及感病土壤對連作番茄根結(jié)線蟲病發(fā)病程度及各種抗氧化酶活性的影響，并對土壤中的微生物數(shù)量進(jìn)行初步研究，以期為深入了解精胺代謝對連作番茄根結(jié)線蟲病連作障礙發(fā)生的微生態(tài)機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試番茄種子由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院王揚(yáng)老師惠贈，供試土壤于2016年9月采自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室，是上茬經(jīng)不同濃度精胺處理的番茄根區(qū)土壤，經(jīng)過貝爾曼法測定得到病土中的線蟲密度為4 000條/kg，上茬的處理方法是對番茄苗葉面噴施精胺溶液，連續(xù)噴霧5 d，第6天開始接種線蟲，接種二齡線蟲1 000頭/株。試驗中的精胺溶液設(shè)置5個濃度梯度處理，分別用A、B、C、D、N、CK表示，即A：1.0 mmol/L Spm+根結(jié)線蟲；B：1.5 mmol/L Spm+根結(jié)線蟲；C：2.0 mmol/L Spm+根結(jié)線蟲；D：3.0 mmol/L Spm+根結(jié)線蟲；N：病土對照；CK：健康土壤對照；噴施時間是每天 09：00—10：00。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：3.0 g牛肉膏，10.0 g蛋白胨，5.0 g NaCl，15.0～25.0 g瓊脂，1 000 mL水，pH值為7.4～7.6。

PDA培養(yǎng)基：1 000 mL 20%馬鈴薯浸出液，10～20 g葡萄糖，17～20 g瓊脂。

1.2 試驗方法

將番茄種子用70%乙醇消毒30 s，再用5%次氯酸鈉溶液消毒2 min，用無菌水清洗3次。將消毒后的種子播于育苗盤中，約1個月后，當(dāng)番茄苗長出3～4張真葉時，移栽到上茬經(jīng)過不同濃度Spm處理的番茄根區(qū)土壤里，每個處理5次重復(fù)。

1.3 連作番茄生理指標(biāo)的測定

1.3.1 番茄葉片抗氧化酶活性測定 移栽30 d后，取溫室中番茄植株的根及葉片，清洗干凈，測定番茄生長勢，統(tǒng)計根結(jié)數(shù)量，計算根結(jié)指數(shù)，計算方法參照文獻(xiàn)[6-7]；并測定過氧化物酶(peroxidase，簡稱POD)活性、過氧化氫酶(catalase，簡稱CAT)活性、丙二醛(malondialdehyde，簡稱MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，簡稱SOD)活性，測定方法參照文獻(xiàn)[8-9]。

1.3.2 土壤根際微生物數(shù)量的測定及微生物統(tǒng)計 測定方法參照文獻(xiàn)[10]，收集5株植株的栽培土壤，混勻后采用四分法取1 kg土壤，裝入無菌塑料袋帶回實(shí)驗室，于4 ℃冰箱保存。準(zhǔn)確稱取10 g待測土壤樣品，放入裝有90 mL無菌水并放有小玻璃珠的250 mL三角瓶中，用手或置搖床上振蕩20 min，使微生物分散，靜置20～30 s，即可得到10-1稀釋液；連續(xù)稀釋，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等一系列稀釋菌液，然后將稀釋菌液涂至盛有培養(yǎng)基的平板上，將涂抹好的平板平放于桌上20～30 min，使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi)，然后將平板倒置，于25～28 ℃黑暗培養(yǎng)，至長出菌落后進(jìn)行計數(shù)，測定土壤中細(xì)菌、真菌的數(shù)量，微生物計數(shù)采用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行，從接種后的5個稀釋度中選擇一個合適的稀釋度進(jìn)行計數(shù)。選擇時注意同一稀釋度各個重復(fù)的菌數(shù)相差不能太懸殊。每皿30～300個細(xì)菌菌落為宜；每皿10～100個真菌菌落為宜。如果菌落很多，可將其分成2～4等份進(jìn)行計數(shù)。細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，真菌采用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理水平對連作番茄生理的影響

由表1可知，在南方根結(jié)線蟲侵染和精胺處理后，番茄的生長會受到抑制，與健康土壤對照相比，株高受到影響。不同濃度的精胺處理對連作番茄根結(jié)線蟲病有一定的影響，其中1.0 mmol/L精胺處理后，番茄的莖粗最大，為0.73 cm，此時根結(jié)數(shù)量最少，最大根結(jié)直徑最小。

表1 不同處理對連作番茄生長勢的影響

2.2 不同處理對連作番茄超氧化物歧化酶的影響

由圖1可知，與健康土壤對照相比，其他處理的超氧化物歧化酶活性均有所增加，說明噴施精胺能夠提高番茄的超氧化物歧化酶活性，且當(dāng)精胺濃度為1.0 mmol/L時，處理后連作番茄的超氧化物歧化酶濃度增加得最多，能夠有效提高番茄對根結(jié)線蟲病的抗性。這一結(jié)果與盧樹昌等的研究結(jié)果[11]基本一致。

2.3 不同處理對連作番茄過氧化物酶活性的影響

過氧化物酶在植物體內(nèi)包括組成型表達(dá)和誘導(dǎo)表達(dá)，其中誘導(dǎo)表達(dá)的誘導(dǎo)因子非常廣泛，既有生物類激發(fā)子(如各類病原物的侵染等)，也有高溫、冷凍、干旱、風(fēng)力、重金屬離子、機(jī)械損傷等非生物類激發(fā)子[12]。由圖2可知，根結(jié)線蟲侵染后，對連作番茄過氧化物酶活性的影響不大，而經(jīng)過噴施1.0 mmol/L精胺后，番茄的過氧化氫酶活性明顯增強(qiáng)。說明在南方根結(jié)線蟲脅迫下精胺能夠提高連作番茄的抗逆性。

2.4 不同處理對連作番茄丙二醛含量的影響

由圖3可知，在南方根結(jié)線蟲侵染后，丙二醛的含量明顯增加，不同濃度的精胺處理對番茄丙二醛含量的影響較大，健康土壤對照的番茄丙二醛含量比其他處理組低，其中 1.0 mmol/L 精胺代謝能夠明顯降低膜脂過氧化程度。說明精胺處理對連作番茄根結(jié)線蟲病有一定的抑制作用。

2.5 不同處理組對連作番茄過氧化氫酶活性的影響

由圖4可知，與健康土壤對照相比，南方根結(jié)線蟲處理后，番茄的過氧化氫酶活性下降。經(jīng)過不同濃度的精胺處理后，過氧化氫酶活性變化差異較大，隨著精胺濃度的增加，過氧化氫酶活性呈下降趨勢，即當(dāng)精胺濃度為1.0 mmol/L時，過氧化物酶活性最大，為9.25 U/(g·min)，當(dāng)精胺濃度為 3.0 mmol/L 時，過氧化氫酶活性最低，為1.75 U/(g·min)。這與陳金鋒等的研究結(jié)果[13]相似。

2.6 不同處理組對土壤細(xì)菌數(shù)量的影響

土壤生物群落結(jié)構(gòu)的變化可以作為土壤變化的早期預(yù)警生態(tài)指標(biāo)[14]。由圖5可知，健康土壤對照處理番茄根區(qū)土壤中細(xì)菌總數(shù)是1.78×106CUF/g，A、B處理土壤中的細(xì)菌數(shù)量較多，分別為3.10×106、2.43×106CFU/g，土壤細(xì)菌數(shù)量最少的是N處理，為1.46×106CFU/g?？梢姴煌幚韺ΩH土壤中細(xì)菌數(shù)量的影響不同。A處理土壤中細(xì)菌總量最多，其次是B處理，C、D處理的土壤中細(xì)菌數(shù)量與CK、N處理相差不大。

2.7 不同處理組對土壤真菌數(shù)量的影響

由圖6可知，經(jīng)過不同處理后番茄根際土壤真菌數(shù)量的變化趨勢與細(xì)菌不同。CK處理的土壤中真菌數(shù)量為8.5×103CFU/g，N處理的土壤中真菌數(shù)量為6.9×103CFU/g，A處理的土壤中真菌數(shù)量為4.6×103CFU/g，B處理的土壤中真菌數(shù)量為 2.8×103CFU/g，CK與各處理之間的土壤中真菌數(shù)量差異較明顯。

3 討論與結(jié)論

3.1 精胺代謝對連作番茄根結(jié)線蟲病的生長勢的影響

經(jīng)過不同處理后，從南方根結(jié)線蟲對連作番茄生長勢的影響來看，N處理番茄根系上的根結(jié)直徑最大，為0.08 cm；A處理的番茄根結(jié)數(shù)量最少，為20.75個，此時形成的根結(jié)最大直徑僅為0.03 cm，莖粗最大，因此，從連作番茄的長勢和抑制根結(jié)的形成來看，A處理的土壤對連作番茄根結(jié)線蟲病的抑制效果較好。

3.2 精胺代謝對連作番茄根結(jié)線蟲病幾種抗氧化酶活性的影響

番茄感染南方根結(jié)線蟲病之后，超氧化物歧化酶活性與健康土壤對照相比有所增強(qiáng)，噴施精胺能夠提高番茄的超氧化物歧化酶活性，當(dāng)精胺濃度為 1.0 mmol/L 時，超氧化物歧化酶濃度增加得最多，能夠有效提高番茄對根結(jié)線蟲病的抗性。根結(jié)線蟲侵染后，番茄的過氧化物酶活性升高，1.0、3.0 mmol/L 精胺處理后，番茄的過氧化物酶活性明顯增強(qiáng)。本研究結(jié)果表明，在南方根結(jié)線蟲侵染后，精胺濃度不同對番茄丙二醛含量影響較大，健康土壤對照的番茄丙二醛含量比其他處理組低，精胺處理后的土壤栽培的番茄丙二醛含量比N處理低，說明精胺處理對連作番茄根結(jié)線蟲病有一定的抑制作用。南方根結(jié)線蟲處理后，與CK相比，番茄的過氧化氫酶活性降低，經(jīng)過不同濃度精胺處理后的過氧化氫酶活性與CK組差異明顯，當(dāng)精胺濃度為3.0 mmol/L時，過氧化氫酶活性最低，為1.75 U/g。在植物與病原物互作過程中，這些過氧化物酶活性的升高可能是由于合成了對細(xì)胞有毒的產(chǎn)物，也可能由于誘導(dǎo)植物細(xì)胞壁發(fā)生了改變，形成物理屏障物，引起細(xì)胞死亡，抑制病原菌侵染，從而參與了植物的抗病作用。

3.3 精胺代謝對連作番茄根結(jié)線蟲病土壤微生物的影響

連作會導(dǎo)致微生物區(qū)系發(fā)生改變，土壤病原真菌數(shù)量增加，有益拮抗菌數(shù)量減少，由細(xì)菌型土壤向真菌型土壤轉(zhuǎn)化；土壤病蟲基數(shù)增加，根際土壤中放線菌密度降低等一系列不良影響的發(fā)生，嚴(yán)重影響了番茄的生長發(fā)育，從而導(dǎo)致大幅度減產(chǎn)甚至絕收[15]。土壤中存在著大量的微生物，在一定程度上土壤微生物群落調(diào)節(jié)著土壤乃至整個生態(tài)系統(tǒng)的功能。土壤微生物以細(xì)菌的種類和數(shù)量最多[16]。細(xì)菌在土壤營養(yǎng)元素循環(huán)、有機(jī)物質(zhì)的形成和分解、肥力的保持和提高、生態(tài)環(huán)境的改善、植物的生長發(fā)育和作為病蟲害防治等方面均起著極其重要的作用[17]。本研究結(jié)果表明，精胺及其代謝物對番茄連作中根結(jié)線蟲病有一定的抑制作用。

本研究結(jié)果表明，精胺在番茄短期連作中能夠促進(jìn)土壤中細(xì)菌數(shù)量增加，真菌數(shù)量減少，番茄葉片中各種酶活性逐漸上升，番茄生長勢良好，并且能夠減少植物根結(jié)線蟲病害的發(fā)生，提高土壤肥力，使微生態(tài)環(huán)境向良性方向發(fā)展，這為將來的研究提供一個參考和方向，對茄科植物的生產(chǎn)實(shí)踐也具有一定的指導(dǎo)意義。