王世鋒， 米耶斯?fàn)枺?詹建立， 張秀英， 王玉濤

(喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆喀什 844000)

綿羊與人類生活密切相關(guān)，為人類提供了肉、脂、奶、皮、毛、絨、骨和角等多種多樣的畜產(chǎn)品[1-3]。關(guān)于綿羊的起源仍存在爭(zhēng)議，線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)序列分析已經(jīng)確定了一種多母系血統(tǒng)的普遍現(xiàn)象，即A、B、C、D、E進(jìn)化世系，這些世系有特定的地理范圍，暗示多重母系起源，羊馴化事件可能是獨(dú)立的[4]。目前，研究發(fā)現(xiàn)僅歐洲摩弗倫羊可能是家綿羊的母系(世系B)野生祖先之一。推測(cè)亞洲摩弗倫羊與歐洲摩弗倫羊與家綿羊共享最近的母系祖先[5]，未發(fā)現(xiàn)其他野生羊?qū)揖d羊有遺傳貢獻(xiàn)的分子證據(jù)。

線粒體是真核細(xì)胞的動(dòng)力車間，mtDNA作為獨(dú)立與核DNA的半自主性基因組，是核外遺傳物質(zhì)，動(dòng)物體線粒體基因組編碼的37個(gè)基因，包括13條多肽，22個(gè)tRNA基因和2個(gè)rRNA基因[6]，具有分子量小、進(jìn)化速度快、多挎貝、堿基替換率低、遺傳自主及母系遺傳等特征。

ND2基因是mtDNA的1個(gè)蛋白編碼基因，而且是NADH脫氫酶的1個(gè)亞基，而NADH脫氫酶是呼吸鏈復(fù)合體1的主要組成，在呼吸鏈中直接參與氫與電子傳遞并通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，進(jìn)而參與能量代謝作用。NAD參與生物體內(nèi)的重要反應(yīng)，NAD可在糖酵解途徑與三羧酸循環(huán)途徑得到電子形成NADH，NADH又在氧化磷酸化途徑中將電子通過呼吸鏈最終傳遞給氧，促成ATP的形成[7]。在體內(nèi)大多數(shù)代謝脫下的氫，是由NADH呼吸鏈傳遞給氧，糖類碳水化合物、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的分解代謝，脫氫后的氧化反應(yīng)一般是由NADH呼吸鏈傳遞完成的。

魯衛(wèi)衛(wèi)等報(bào)道雞線粒體ND2基因的異質(zhì)性，并發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性變異對(duì)生長(zhǎng)性狀、屠體指標(biāo)、血清生化等指標(biāo)均有顯著效應(yīng)，顯示相關(guān)變異的潛在重要性[7]。鮑海港等在對(duì)藏雞的研究中發(fā)現(xiàn)，線粒體ND1和ND2基因可被選為藏雞低氧遺傳適應(yīng)的候選基因，因?yàn)榈脱鯐?huì)抑制與線粒體呼吸功能密切相關(guān)的酶的活性，也會(huì)使線粒體產(chǎn)生更多的活性氧?；钚匝鯐?huì)破壞膜脂，降低線粒體呼吸酶的活性，從而損害線粒體的呼吸功能。研究發(fā)現(xiàn)，3種雞都有但頻率差異較大的2個(gè)錯(cuò)義突變都是ND2基因上的單堿基突變，推測(cè)藏雞與低地雞有可能在NADH脫氫酶的功能上存在差異[8]。而有關(guān)高山放牧品種的塔什庫(kù)爾干羊(海拔3 000～5 000 m)、和田羊(分為山區(qū)型和農(nóng)區(qū)型，海拔1 440～3 500 m)和多浪羊(海拔1 200 m)線粒體呼吸功能和低氧適應(yīng)研究較少。

本研究通過測(cè)定綿羊線粒體ND2基因序列，從而探討新疆南疆地區(qū)綿羊的遺傳多樣性、線粒體呼吸功能及低氧適應(yīng)的分子機(jī)制，從而了解并摸清其親緣關(guān)系及低氧適應(yīng)性，為能夠綜合開發(fā)和合理利用綿羊資源提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

于2014年3月至2015年8月先后在麥蓋提縣種羊場(chǎng)采集33只多浪羊、塔什庫(kù)爾干縣麻扎種羊場(chǎng)采集41只塔什庫(kù)爾干羊、和田市屠宰場(chǎng)采集17只和田羊共計(jì)91只羊的靜脈血液，用檸檬酸葡萄糖(ACD)抗凝，冷凍后置于冰袋中，于實(shí)驗(yàn)室-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

糞便基因組DNA快速提取試劑盒、全血基因組DNA快速提取試劑盒，均購(gòu)自北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司；TaqDNA聚合酶、dNTP，均為杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖為BIOWEST公司產(chǎn)品。

1.3 總DNA提取

綿羊總基因組DNA的提取是利用全血基因組DNA快速提取試劑盒(北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。

1.4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

根據(jù)綿羊mtDNA序列(GenBank登錄號(hào)為AF010406)，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增綿羊ND2基因，上游引物：5′-AGCACCCACTGATTGCTCAT-3′，下游引物：5′-TTCGTTTTGTGGTTGGGAAT-3′。委托北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，期望擴(kuò)增長(zhǎng)度約901 bp。

PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL：綿羊總基因組4 μL，10×Buffer(含Mg2+)5 μL，上下游引物各2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，TaqDNA聚合酶1 μL，去離子水29 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接送北京三博遠(yuǎn)志生物公司測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Clustal X 1.83軟件進(jìn)行序列比對(duì)并手工校對(duì)。DnaSP 5.1軟件計(jì)算單倍型多樣度、核苷酸多樣度、多態(tài)位點(diǎn)、核苷酸總變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和點(diǎn)突變位點(diǎn)等。MEGA 5.1 軟件分析變異位點(diǎn)，計(jì)算堿基組成、轉(zhuǎn)換/顛換比(Ts/Tv)、核苷酸差異和序列差異，采用鄰接法(Neighbour-Joining，簡(jiǎn)稱NJ)Kimura雙參數(shù)模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，對(duì)拓?fù)鋱D進(jìn)行重復(fù)抽樣1 000次的自展檢驗(yàn)(Bootstrap)以確定各分支的置信度。

2 結(jié)果與分析

2.1 ND2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

ND2基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳20 min，結(jié)果見圖1。

電泳條帶明亮，擴(kuò)增效果較好，擴(kuò)增條帶大小為900 bp左右，與預(yù)期擴(kuò)增的901 bp一致?？梢灾苯訙y(cè)序。

2.2 綿羊mtDNA-ND2全序列堿基分析

測(cè)序結(jié)果表明，所測(cè)出的綿羊mtDNA-ND2基因A、T、C、G含量在綿羊中分布較一致，其中A占36.8%，T占 27.4%，C占27.1%，G占8.7%。綿羊的A+T含量為 64.2%，C+G含量為35.8%，A+T含量高于C+G含量；表明綿羊mtDNA-ND2基因含有大量的堿基A和T，存在一定的堿基偏倚性。堿基組成表明G相對(duì)缺乏，其中密碼子第3位上G的含量最低，僅為2.6%；第3位的A含量較高，為49.8%。密碼子的使用存在一定差異，在密碼子的第1位上A高達(dá)43.4%；密碼子第2位上T的含量高達(dá)45.0%，堿基G的含量為9.1%。

2.3 綿羊mtDNA-ND2序列的多樣性分析

利用DnaSP 5.1軟件進(jìn)行單倍型統(tǒng)計(jì)分析，本試驗(yàn)分析91個(gè)綿羊mtDNA-ND2基因序列，發(fā)現(xiàn)了22個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，其中有9個(gè)單一多態(tài)位點(diǎn)，簡(jiǎn)單信息位點(diǎn)(2個(gè)堿基)有13個(gè)(圖2)。其中438、504、837、873位點(diǎn)核酸變異只出現(xiàn)在塔什庫(kù)爾干羊個(gè)體中。核酸變異中轉(zhuǎn)換遠(yuǎn)大于顛換，轉(zhuǎn)換/顛換比為78.38。

2.4 ND2氨基酸分析

22個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中的2個(gè)位點(diǎn)即299、883位點(diǎn)是非同義突變，分別導(dǎo)致M變?yōu)門和R變?yōu)镚，其余20個(gè)位點(diǎn)為同義突變。應(yīng)用SWISS-MODEL(httP：//swissmodel.expasy.org/interactive# structure)軟件進(jìn)行ND2結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)，多肽空間結(jié)構(gòu)見圖3。

單倍型H1序列未發(fā)生突變，H8序列在299位點(diǎn)和883位點(diǎn)均發(fā)生突變。由圖3可知，突變后空間結(jié)構(gòu)差異不大。但是QMEAN分別為-4.35和-4.38，Cβ分別為-1.72和 -1.82，All Atom分別為-1.27和-13.2，Torsion分別為 -4.32 和-4.33，Solvation均為1.47，未發(fā)生變化。

2.5 mtDNA-ND2基因單倍型分析

共獲得13個(gè)單倍型，各單倍型在各品種中分布見表1。

由表1可知，H2和H1為優(yōu)勢(shì)單倍型，分別占58.3%和13.2%。綿羊群體單倍型多樣度(Hd)為0.641，核苷酸多樣度(Pi)為：0.357%，平均核苷酸差異數(shù)(k)為3.4。塔什庫(kù)爾干羊、和田羊和多浪羊核苷酸多樣度分別為0.330%、0.135%、0.463%。

2.6 綿羊系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA 5.05軟件構(gòu)建綿羊ND2基因不同單倍型NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。其中包括GenBank下載的36個(gè)序列分別是A世系(HM236174-5)、B世系(AM236176-7)、C世系(AM236178-9)、D世系(HM236180-1)、E世系(HM236182-3)序列、盤羊線粒體序列(藏盤羊JX101654.1、帕米爾盤羊KT781689.1、Darwini盤羊KX609626.1、東方盤羊NC020656.1、HM236188.1、加拿大盤羊NC015889.1、JN181255.1)、Vignei(HM236186.1、HM236187.1、HM236189.1、NC026064.1、KF938361)、摩弗倫羊(HM236185、KF312238.1、KF938360.1、NC026063.1)、新疆地方綿羊阿勒泰羊(KF938320.1)、和田羊(KF938322.1)、吐魯番黑羊(KF938324.1)、巴什拜羊(KF938330.1)巴音布魯克羊(KF938331.1)、多浪羊(KF938332.1)、哈薩克羊(KF938333.1)、塔什庫(kù)爾干羊(KF938337.1)、葉城羊(KF938338.1)。

表1 各單倍型在各品種中的分布

由圖4可知，單倍型H2、H3、H9、H10、H11和H13屬于A世系；單倍型H1、H4和H7與歐洲摩弗侖羊和亞洲摩弗倫羊?qū)儆贐世系；H5、H6和H8與塞浦路斯摩弗倫羊?qū)儆贑世系；H12屬D世系。

2.7 3個(gè)品種間的遺傳距離及系統(tǒng)發(fā)生樹

利用MEGA 5.0計(jì)算不同品種間遺傳距離(表2)，根據(jù)遺傳距離構(gòu)建不同品種間NJ系統(tǒng)發(fā)生樹(圖5)。由圖5可知，塔什庫(kù)爾干羊與和田羊關(guān)系較近，其次是多浪羊。

表2 3個(gè)品種間的遺傳距離

3 討論

綿羊的A+T含量為64.2%，C+G含量為35.8%，A+T含量高于C+G含量；表明綿羊mtDNA-ND2基因含有大量的堿基A和T，存在一定的堿基偏倚性，與筆者前期研究結(jié)果[9-10]一致。

基因變異發(fā)生在密碼子第1、2、3位置分別占9.09%、4.55%、86.36%，與前期研究結(jié)果[9]一致。

轉(zhuǎn)換顛換比78.38遠(yuǎn)大于36.81[9]和轉(zhuǎn)換顛換比的臨界值2，說明新疆南疆地區(qū)地方綿羊ND2基因序列突變可能未達(dá)到飽和狀態(tài)，轉(zhuǎn)換隨著遺傳變異增加趨于飽和。

馬麗娜等在蒙古羊和小尾寒羊上發(fā)現(xiàn)770位點(diǎn)上發(fā)生了T到C的轉(zhuǎn)換[11]，本研究未發(fā)現(xiàn)此變異。

438、504、837、873位點(diǎn)核酸變異只出現(xiàn)在塔什庫(kù)爾干羊個(gè)體中，單倍型H3、H4、H10和H13也只分布于塔什庫(kù)爾干羊中，是否與其NADH脫氫酶功能差異和低氧適應(yīng)有聯(lián)系，仍需進(jìn)一步研究。另外單倍型H8序列在299位點(diǎn)和883位點(diǎn)均發(fā)生突變。突變后ND2亞基空間結(jié)構(gòu)差異不大，但是多肽部分性質(zhì)發(fā)生改變，是否影響線粒體呼吸功能有待進(jìn)一步探討。

單倍型H12只分布于多浪羊中，與D世系聚在一起，表明多浪羊存在世系D，與基于細(xì)胞色素b的分析結(jié)果[9]一致。和田羊未發(fā)現(xiàn)世系C，可能與研究樣品數(shù)量偏少有關(guān)。

3個(gè)品種平均核苷酸多樣度(Pi)為0.357%，塔什庫(kù)爾干羊、和田羊和多浪羊核苷酸多樣度分別為0.330%、0.135%、0.463%，低于趙倩君等[12]、王昕等[13]、張傳生等[14]基于細(xì)胞色素b研究的0.805%、0.602%、0.850%。但與筆者基于細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因分析塔什庫(kù)爾干羊的0.421%接近。

基于ND2基因的系統(tǒng)發(fā)生樹表明摩弗倫羊可能是家綿羊世系B的野生祖先，與前人研究觀點(diǎn)[5]一致。但是塞浦路斯摩弗倫羊與是世系C聚在一起，可能對(duì)世系C有遺傳貢獻(xiàn)，此觀點(diǎn)有待進(jìn)一步驗(yàn)證。另外塔什庫(kù)爾干羊與和田羊關(guān)系較近，其次是多浪羊，此觀點(diǎn)與湯存?zhèn)サ然谖⑿l(wèi)星的分析結(jié)果[15]一致。