張校立， 艾沙江·買買提， 徐葉挺， 許 娟， 鄧 莉， 王繼勛

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所/農(nóng)業(yè)部新疆地區(qū)果樹科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站，新疆烏魯木齊 830091)

新疆地方梨品種屬于新疆梨系統(tǒng)。新疆梨系統(tǒng)是梨五大栽培系統(tǒng)之一，代表品種是著名的庫爾勒香梨(PyrusbretschneideriRehd)。庫爾勒香梨維吾爾語名乃西米提或乃西普提，蒙古語名為開登木，原產(chǎn)新疆庫爾勒地區(qū)，在新疆已有1 400多年的栽培歷史，其果實(shí)香味濃郁、皮薄肉脆、清甜爽口、細(xì)嫩多汁、耐貯藏性強(qiáng)，是新疆名特優(yōu)果品之一。截至2016年，庫爾勒香梨種植面積達(dá)7.39萬hm2，產(chǎn)量達(dá)128.04萬t[1]，香梨產(chǎn)業(yè)已成為庫爾勒地區(qū)的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)。庫爾勒香梨自交不親和，S基因型為S22S28[2]，自交結(jié)實(shí)率低，需要配置授粉品種，但不同的授粉品種會(huì)對(duì)香梨果實(shí)產(chǎn)生顯著的花粉直感效應(yīng)，突出表現(xiàn)為不同花粉授粉后果實(shí)萼片脫落或宿存，萼片脫落后的幼果發(fā)育成為“母梨”，萼片宿存的幼果發(fā)育成為“公梨”，二者不但外在品質(zhì)果形上差異很大，而且內(nèi)在品質(zhì)和口感上也差異明顯，市場(chǎng)價(jià)格差異非常顯著。徐勝利等研究表明，選擇新疆梨作為授粉品種能夠明顯改善香梨果形和果實(shí)品質(zhì)[3]。鑒定新疆地方梨品種S-等位基因?qū)鞝柪障憷婧侠硎诜燮贩N的選配具有重要的理論意義。梨自交不親和性基因的研究始于20世紀(jì)50年代，國(guó)外最早研究的是Kikuchi、Machida等日本學(xué)者，采用廣泛的田間授粉雜交試驗(yàn)，從日本梨中鑒定了7個(gè)S等位基因，命名為S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7[4-6]。國(guó)內(nèi)最早研究的是烏云塔娜，2003年，從中國(guó)白梨中分離鑒定了7個(gè)新的S基因，分別記為S17、S19、S20、S21、S22、S26、S27等位基因[7]。譚曉風(fēng)等分別從白梨、沙梨及秋子梨等亞洲梨種群分離鑒定了34個(gè)S等位基因[8]。從2003年開始至今采用PCR-RFLP、DNA測(cè)序、雜交檢測(cè)等方法開展了中國(guó)梨自交不親和性的研究，發(fā)現(xiàn)了包括S1～S10基因在內(nèi)的42個(gè)S基因，從中國(guó)梨中克隆了S12、S13、S15、S17～S22、S25～S30、S32、S34、S35、S38～S40、S42、S46等S基因全長(zhǎng)cDNA序列，確定了近500個(gè)梨品種的S基因型。近500個(gè)品種中大部分都是白梨系統(tǒng)、秋子梨系統(tǒng)、沙梨系統(tǒng)的品種，新建梨系統(tǒng)的品種非常少，目前，只有陳慧等鑒定了黃句句(S22S34)、伊犁紅句句(S22S28)、早熟句句(S17S19)、乃希木特阿木提(S19S28)、沙01號(hào)(S22S28)、斯?fàn)柨烁?S22S28)、墨梨(S26Sb)、貴德長(zhǎng)把(S19Sb)等8個(gè)新疆梨系統(tǒng)品種S-基因型[9]。新疆梨地方品種是我國(guó)特有的梨樹資源，新疆地方梨品種S基因型的鑒定研究比較少，大部分新疆地方梨品種的S基因型還未鑒定，我們研究的6個(gè)新疆地方梨品種的基因型目前尚未有人報(bào)道。我們利用DNA測(cè)序技術(shù)鑒定了6個(gè)新疆地方梨品種的S基因型。6個(gè)品種S基因型的鑒定，以期豐富我國(guó)梨品種S基因型信息；為庫爾勒香梨篩選最佳的授粉梨品種提供理論基礎(chǔ)，并可為庫爾勒香梨的豐產(chǎn)栽培技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)，也為香梨品種的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試品種為褐色句句梨、霍城冬黃梨、八月梨、庫爾勒黃酸梨、奎克阿木特2號(hào)、也歷克阿木特。品種均來自新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院輪臺(tái)國(guó)家果樹資源圃。于2017年4月上旬采集各品種幼嫩葉片置于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室后于-80 ℃冷凍保存。

1.2 試劑

ExTaq、pMD18-T Vector、DNA回收試劑盒，購自北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司；DNA提取試劑盒，購于天根科技生化有限公司；其他藥品均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3 基因組DNA提取

參照植物基因組DNA提取試劑盒說明書(柱式植物DNAout2.0，天根科技生化有限公司)提取梨基因組DNA，在1%瓊脂糖凝膠、1×TAE緩沖液、3～5 V/cm下電泳，電泳結(jié)果用上海復(fù)日FR-980凝膠圖成像系統(tǒng)照相，檢測(cè)DNA樣品。

1.4 PCR擴(kuò)增及檢測(cè)

根據(jù)已報(bào)道的梨的S基因相關(guān)信息，獲知梨S基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)由5個(gè)保守區(qū)、1個(gè)高頻可變區(qū)及1個(gè)內(nèi)含子組成。高頻可變區(qū)是花粉識(shí)別的部位。S基因多態(tài)性主要源于高頻可變區(qū)的差異，通常根據(jù)高頻可變區(qū)的差別判斷不同的S基因。因此，根據(jù)S基因一級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，利用S基因高變區(qū)(hypervariable region，HV)的保守序列設(shè)計(jì)合成引物。

正向引物PF：5′-TTTACGCAGCAATATCAG-3′；

反向引物PR：5′-AC(A/G)TTCGGCCAAATAATT-3′。

在江南等擴(kuò)增反應(yīng)體系及反應(yīng)過程[10]的基礎(chǔ)上略作調(diào)整，使用ExTaq酶保證擴(kuò)增結(jié)果的可靠性，擴(kuò)增產(chǎn)物在1.4%瓊脂糖凝膠上于100 V電泳30～45 min，上海復(fù)日FR-980凝膠圖像系統(tǒng)分析拍照并記錄分析。

1.5 PCR產(chǎn)物回收、克隆、測(cè)序

利用凝膠回收試劑盒回收目的DNA片段，與PEASY-T5載體16 ℃條件下過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌Trans1-T1，涂于SOC/Amp50固體培養(yǎng)基上37 ℃過夜。挑選陽性克隆，菌液PCR篩選帶有目的片段長(zhǎng)度的克隆。每個(gè)S基因片段挑選3個(gè)陽性克隆，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果利用Blast與GenBank中已知的S-RNase基因序列比較，確定其S基因型。

2 結(jié)果與分析

2.1 S基因特異性擴(kuò)增

采用S等位基因特異性引物PF和PR對(duì)6個(gè)梨品種基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出，每個(gè)梨品種擴(kuò)增都得到2條S基因特異片段，大約在300～1 500 bp。褐色句句梨、霍城冬黃梨、八月梨、奎克阿木特2號(hào)、也歷克阿木特等5個(gè)品種都擴(kuò)增出明顯的2條帶；庫爾勒黃酸梨擴(kuò)增出來的2條帶不是太明顯，說明這個(gè)品種的S等位基因片段大小相差很小。

2.2 梨品種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)一步進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，PCR產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠上電泳隨遷移率的不同，表現(xiàn)為不同位置的條帶。從圖2可以看出，6個(gè)品種在聚丙烯酰胺凝膠上均呈現(xiàn)2條明顯的條帶，褐色句句梨、霍城冬黃梨、八月梨、奎克阿木特2號(hào)4個(gè)品種的2條帶都在300～500 bp之間；褐色句句梨、霍城冬黃梨的1條約450～500 bp 之間的擴(kuò)增條帶在聚丙烯酰胺凝膠上的位置相同，它們的S基因的堿基序列是否相同有待進(jìn)一步分析；也歷克阿木特的1條帶在1000～1 500 bp內(nèi)，另1條帶在600～1 000 bp 內(nèi)。

2.3 梨品種S基因型的鑒定

聚丙烯酰胺凝膠電泳后回收目的條帶，將克隆后的陽性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，將12條測(cè)定的結(jié)果序列使用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行Blast搜索、同源性比較，根據(jù)分析GenBank內(nèi)S基因的堿基序列及同源性，確定6個(gè)新疆地方梨品種的S基因型。從表1可以看出，6個(gè)品種中S基因的核苷酸序列與GenBank中已登錄的梨S基因有極高的同源相似性，褐色句句梨的S基因與S28、S4基因的相似性達(dá)98%、99%；霍城冬黃梨的S基因與S28、S4基因的相似性達(dá)100%、99%；八月梨S基因與S28、S4基因的相似性達(dá)99%、100%；庫爾勒黃酸梨的S基因與S22、S35基因的相似性達(dá)100%、100%；奎克阿木特2號(hào)的S基因與S4、S16基因的相似性達(dá)100%、100%；也歷克阿木特S基因與S18、S12基因的相似性達(dá)94%、100%。

表1 6個(gè)新疆地方梨品種的S基因型

注：系統(tǒng)為新疆梨；引物為PF/FR。

3 討論與結(jié)論

本研究應(yīng)用PCR技術(shù)和對(duì)S基因特異性擴(kuò)增條帶的測(cè)序，通過DNA序列分析確定了6個(gè)新疆地方梨品種的S基因型。鑒定結(jié)果為：褐色句句梨S28S4、霍城冬黃梨S28S4、八月梨S28S4、庫爾勒黃酸梨S22S35、奎克阿木特2號(hào)S4S16、也歷克阿木特S18S12。同為新疆地方梨品種，它們之間既有相同之處，也有不同之處，如褐色句句梨、霍城冬黃梨、八月梨等3個(gè)品種具有相同的基因型S28S4，這3個(gè)品種間不能相互作授粉品種，因?yàn)樗鼈兙哂邢嗤幕蛐?，如果相互間作授粉品種，就會(huì)出現(xiàn)不結(jié)果或結(jié)果率極低；庫爾勒黃酸梨、奎克阿木特2號(hào)、也歷克阿木特3個(gè)品種的基因型不相同，這3個(gè)品種間可以相互作授粉品種。褐色句句梨、霍城冬黃梨、八月梨3個(gè)品種具有相同的基因型，并且都具有庫爾勒香梨的S28，庫爾勒黃酸梨具有庫爾勒香梨的S22基因，表明褐色句句梨、霍城冬黃梨、八月梨、庫爾勒黃酸梨與庫爾勒香梨在起源上相關(guān)性比較大，奎克阿木特2號(hào)、也歷克阿木特與庫爾勒香梨在起源上相關(guān)性比較小。鑒定出的6個(gè)新疆地方梨品種分別含有S4、S12、S16、S18、S22、S28、S35等S基因，這些基因分別屬于白梨系統(tǒng)、沙梨系統(tǒng)和西洋梨系統(tǒng)的S基因，初步推論新疆地方梨品種可能是白梨系統(tǒng)、沙梨系統(tǒng)和西洋梨系統(tǒng)的雜種，雜種后代又經(jīng)過長(zhǎng)期的自然雜交，互相演化而來成現(xiàn)在的品種。在果樹育種學(xué)上，沈德緒等認(rèn)為，新疆梨可能是西洋梨與白梨的雜交種[11]。新疆地方梨品種具體的起源與分類還需對(duì)其更多品種的S-基因進(jìn)行鑒定，并需要進(jìn)一步的分析與研究。

6個(gè)新疆地方梨品種基因型的鑒定，增加了我國(guó)6個(gè)新疆梨品種的S基因型信息，可為庫爾勒香梨授粉品種的篩選新疆地方梨品種提供理論依據(jù)。褐色句句梨、霍城冬黃梨、八月梨3個(gè)品種具有庫爾勒香梨的S28基因，庫爾勒黃酸梨具有庫爾勒香梨的S22基因，表明褐色句句梨、霍城冬黃梨、八月梨和庫爾勒黃酸梨不太適宜作庫爾勒香梨的授粉品種；奎克阿木特2號(hào)與也歷克阿木特可以作為庫爾勒香梨的授粉品種，但其授粉后對(duì)庫爾勒香梨品質(zhì)的影響，還需開展進(jìn)一步研究。