梁雨婷，隋燚，莊子昕，徐其征，張蕊，周賀

(1.大連海洋大學(xué) 遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧省省級(jí)高校海洋生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部北方海水產(chǎn)增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連 116023; 2.馬鞍山市農(nóng)業(yè)委員會(huì)，安徽 馬鞍山 243000)

泥鰍Misgurnusanguillicaudatus在中國(guó)分布廣泛，其肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，是一種小型經(jīng)濟(jì)淡水魚類。據(jù)報(bào)道，中國(guó)泥鰍存在二倍體(2n=50)、三倍體(3n=75)、四倍體(4n=100)和六倍體(6n=150)[1-2]。多倍體魚類與二倍體魚類相比，具有生長(zhǎng)迅速、產(chǎn)量高、抗病力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。在三倍體泥鰍的相關(guān)研究中，有通過冷休克、熱休克和靜水壓等方法人工誘導(dǎo)成功的先例[3]，而本實(shí)驗(yàn)室通過二倍體與四倍體泥鰍雜交的方法成功獲得雜交三倍體泥鰍[4]，并對(duì)雜交三倍體泥鰍的染色體組穩(wěn)定性進(jìn)行了一系列研究[5-8],結(jié)果表明，二倍體泥鰍(2n)與天然四倍體泥鰍(4n)正、反雜交后代均出現(xiàn)大量能存活的非整三倍體個(gè)體，并隨養(yǎng)殖時(shí)間的延長(zhǎng)，非整三倍體率呈下降趨勢(shì)。關(guān)于雜交三倍體泥鰍與二倍體泥鰍雜交后代胚胎染色體組構(gòu)成的研究國(guó)內(nèi)外尚無報(bào)道，本研究中以雜交三倍體泥鰍(3n)與二倍體泥鰍(2n)為研究對(duì)象，配制不同雜交組合(3n♀×2n♂、2n♀×3n♂)，對(duì)其后代的胚胎染色體進(jìn)行銀染(Ag-NORs)、CMA3/DA/DAPI三重?zé)晒馊旧?、熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)等研究，旨在為雜交三倍體泥鰍配子染色體組構(gòu)成及雜交三倍體泥鰍的育性提供細(xì)胞遺傳學(xué)證據(jù)，也為三倍體魚類產(chǎn)業(yè)化探索高效、易行的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用性腺發(fā)育良好的雜交三倍體(3n=75)泥鰍雌、雄各2尾，體長(zhǎng)為10.90～14.20 cm，體質(zhì)量為10.00～22.19 g；二倍體(2n=50)泥鰍雌、雄各2尾，體長(zhǎng)為10.80～16.60 cm，體質(zhì)量為8.54～15.50 g。

1.2 方法

1.2.1 人工催產(chǎn)及授精 采用雜交三倍體泥鰍

(2n♀×4n♂)2尾(雌、雄各1尾)與二倍體泥鰍2尾(雌、雄各1尾)進(jìn)行1∶1雜交，人工進(jìn)行催產(chǎn)，干法受精，配制2n♀×3n♂、3n♀×2n♂雜交組合。

1.2.2 染色體標(biāo)本的制備 待受精卵發(fā)育至眼泡期后期時(shí)即可剝掉卵膜、去掉卵黃，用0.002 5%的秋水仙素處理45 min后，再用0.8%的檸檬酸鈉低滲 20 min；將低滲液吸出，加入-20 ℃下預(yù)冷的卡諾固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)3次，每次處理15 min，之后再換入新的卡諾固定液，冷凍過夜(>12 h)；冷滴片，鏡檢。

1.2.3 銀染(Ag-NORs) 采用Howell等[9]提出的銀染法，在加熱器(65 ℃)中預(yù)熱染色體標(biāo)本，將硝酸銀溶液和明膠溶液以2∶1的比例混合后滴到染色體標(biāo)本上，蓋上蓋玻片；在加熱器(65 ℃)中處理2～3 min，當(dāng)染色體標(biāo)本呈金黃色時(shí)取出沖洗，風(fēng)干封片，在顯微鏡下觀測(cè)并拍照。

1.2.4 CMA3/DA/DAPI三重?zé)晒馊旧?采用Schweizer等[10-11]報(bào)道的方法，用0.5 mg/mL Chromomycin A3(CMA3)染色60 min， 0.1 mg/mL Distamycin A(DA)和0.5 μg/mL 4, 6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)分別染色 15 min。每次染色后均用MacIlvaine buffer(MI，pH=7.0)緩沖液漂洗2次，染色完成后用1∶1的甘油和MI緩沖液的混合溶液封片，鏡檢并拍照。

1.2.5 染色體熒光原位雜交(FISH) 以人的5.8S +28S rDNA為探針，采用生物素(Biotin-16-dUTP)進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記后的探針用100%酒精進(jìn)行純化，并加入雜交緩沖液中，80 ℃下處理10 min，迅速移到冰水中；將提前制備的并已經(jīng)干燥3 h的染色體標(biāo)本浸入到70 ℃的70%甲酰胺/2×SSC變性液中變性2 min，分別用-20 ℃預(yù)冷的70%酒精、100%酒精脫水，空氣中干燥；將50 μL變性探針-雜交溶液混合液滴加在染色體標(biāo)本上，蓋好封口膜，置于2×SSC濕盒中于37 ℃下雜交18 h以上；將染色體標(biāo)本在洗脫液中洗脫，進(jìn)行雜交信號(hào)檢測(cè)和放大，復(fù)染并封片，用Leica DM2000熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.6 染色體核型分析 染色體分類參照Levan等[12]提出的分類依據(jù)。用Adobe Photoshop 7.0 CS2軟件分析上述試驗(yàn)中染色體均勻分散且形態(tài)清晰完整的中期分裂相照片。測(cè)量每條染色體長(zhǎng)臂長(zhǎng)、短臂長(zhǎng)，并計(jì)算出臂比和相對(duì)長(zhǎng)度。定義長(zhǎng)臂長(zhǎng)與短臂長(zhǎng)的比值為臂比；某一條染色體全長(zhǎng)占單倍染色體組的染色體總長(zhǎng)度的百分比為該染色體的相對(duì)長(zhǎng)度。按臂比將染色體分為4組：臂比為1.0～1.7時(shí)，為中部著絲粒染色體(m)；臂比為1.7～3.0時(shí),為亞中部著絲粒染色體(sm)；臂比為3.0～7.0時(shí),為亞端部著絲粒染色體(st)；臂比大于7.0時(shí),為端部著絲粒染色體(t)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ag-NORs

二倍體與三倍體泥鰍正反交后代染色體中期分裂相Ag-NORs均較明顯，最高銀染點(diǎn)數(shù)均為3個(gè)(圖1-A、C)。通過核型分析可知，2n♀×3n♂及3n♀×2n♂雜交后代染色體中期分裂相Ag-NORs均位于中部著絲粒染色體(M1)的端部區(qū)域(圖1-B、D)。

2.2 CMA3/DA/DAPI

二倍體與三倍體泥鰍正反交后代染色體中期分裂相都顯示有明亮的 CMA3陽(yáng)性部位，如圖2-A、C白色箭頭所示。經(jīng)核型分析可知，兩種雜交后代染色體中期分裂相CMA3陽(yáng)性位點(diǎn)均位于中部著絲粒染色體(M1)的端部區(qū)域(圖2-B、D)，該區(qū)域即核仁組織區(qū)，與Ag-NORs結(jié)果一致，位置相同。

2.3 FISH

利用人的5.8S+28S rDNA為探針,對(duì)2n與3n泥鰍正反交后代染色體進(jìn)行FISH定位。圖3中黃綠色區(qū)域即為5.8S+28S rDNA雜交信號(hào)，二者染色體中期分裂相均出現(xiàn)3個(gè)雜交信號(hào)位點(diǎn)(圖3-A、C)。根據(jù)核型分析，2n♀×3n♂、3n♀×2n♂后代染色體分裂相的雜交信號(hào)均位于第一對(duì)中部著絲粒染色體的端部(圖3-B、D)，與上述銀染、CMA3結(jié)果一致，位置相同。

3 討論

3.1 銀染

NORs的分布、形態(tài)特征和數(shù)目可作為研究生物物種間染色體進(jìn)化和親緣關(guān)系的一個(gè)指標(biāo)[13]。銀染法是指核仁組織區(qū)(NORs)的酸性蛋白成分被硝酸銀特異地染成黑色的方法。NORs表現(xiàn)出具有轉(zhuǎn)錄活性或潛在轉(zhuǎn)錄活性，其如果失活將染不上色。細(xì)胞中核仁數(shù)目與染色體倍性一致，含1個(gè)核仁為單倍體細(xì)胞，含2、3、4個(gè)核仁分別為二、三、四倍體細(xì)胞。與其他倍性檢測(cè)方法相比，銀染法快速準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單，無須特殊儀器設(shè)備，是一種值得推廣的多倍體魚類倍性鑒定方法。本研究結(jié)果表明，無論2n♀×3n♂還是3n♀×2n♂雜交后代中，染色體中期分裂相Ag-NORs均較為明顯，最高銀染點(diǎn)數(shù)均為3個(gè)。經(jīng)核型分析可知，2n♀×3n♂及3n♀×2n♂后代染色體中期分裂相Ag-NORs均位于中部著絲粒染色體(M1)的端部區(qū)域。

注：A、B為 2n♀×3n♂; C、D為3n♀×2n♂Note: A,B,2n♀×3n♂; C,D, 3n♀×2n♂圖1 2n♀×3n♂及3n♀×2n♂后代胚胎染色體分裂相Ag-NORs及核型Fig.1 Ag-NORs and karyotypes in chromosomes of embryos from 2n♀×3n♂ and 3n♀×2n♂ loach

注：A、B為 2n♀×3n♂；C、D為 3n♀×2n♂Note: A,B, 2n♀×3n♂; C,D, 3n♀×2n♂圖2 2n♀×3n♂及3n♀×2n♂后代胚胎染色體分裂相的CMA3/DA/DAPI三重?zé)晒馊旧昂诵虵ig.2 CMA3/DA/DAPI staining and karyotypes in chromosomes of embryos from 2n♀×3n♂ and 3n♀×2n♂ loach

3.2 CMA3熒光顯帶

CMA3(Chromomycin A3)是只染GC 堿基的熒光染料，魚類染色體的NORs被特異地顯示。該方法與銀染法不同，CMA3是染 NORs 處的rDNA，而不是酸性蛋白成分，因此，NORs 失活與否，CMA3均可染色，該方法可用于研究NORs 的多態(tài)性及活性，鑒定NORs數(shù)目。DAPI是雙鏈DNA特異的染料，在重復(fù)順序含量高的異染色質(zhì)區(qū)域，也就是富含AT堿基對(duì)的區(qū)域，DAPI與DNA雙鏈的小溝結(jié)合，表現(xiàn)出熒光；而在富有GC 堿基對(duì)的區(qū)域，DAPI則插入雙鏈的堿基之間，產(chǎn)生的熒光較弱或不發(fā)熒光。本研究結(jié)果表明，無論2n♀×3n♂還是3n♀×2n♂雜交后代中，染色體中期分裂相均顯示有明亮的 CMA3陽(yáng)性部位。經(jīng)核型分析可知，2n♀×3n♂及3n♀×2n♂后代染色體中期分裂相CMA3陽(yáng)性位點(diǎn)位于第一對(duì)中部著絲粒染色體(M1)的端部區(qū)域，與Ag-NORs位置相同，為核仁組織區(qū)(NORs)。

注：A、B為 2n♀×3n♂； C、D為3n♀×2n♂Note: A,B, 2n♀×3n♂; C,D, 3n♀×2n♂圖3 5.8S+28S rDNA在2n♀×3n♂、3n♀×2n♂中期分裂相的熒光原位雜交結(jié)果Fig.3 Results of fluorescence of 5.8S+28S rDNA in metaphase situ hybridization of 2n♀×3n♂and 3n♀×2n♂

3.3 核糖體rDNA序列的染色體定位(FISH)

FISH是指通過雜交和熒光顯微鏡進(jìn)行特定DNA序列檢測(cè)的技術(shù)。其原理是利用熒光標(biāo)記的核酸片段為探針，與中期細(xì)胞的染色體或間期細(xì)胞核的DNA進(jìn)行分子雜交，再用抗體與探針分子特異結(jié)合，經(jīng)熒光顯微鏡對(duì)雜交信號(hào)即與探針同源的DNA片段在染色體上或核中定位等進(jìn)行各種分析。可在染色體、細(xì)胞核組織切片標(biāo)本上進(jìn)行DNA雜交，用以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)特定序列DNA或RNA的存在。在魚類基因定位中，F(xiàn)ISH技術(shù)的應(yīng)用主要集中在rDNA的定位上。例如，Li等[14]利用FISH技術(shù)研究了二倍體和四倍體泥鰍的倍性，得到的結(jié)果與通過銀染和CMA3染色得到的NORs 位點(diǎn)相吻合。本研究中利用FISH技術(shù)對(duì)2n♀×3n♂和3n♀×2n♂雜交后代染色體rDNA序列進(jìn)行定位分析，結(jié)果顯示，在2n♀×3n♂和3n♀×2n♂雜交后代胚胎染色體上同時(shí)發(fā)現(xiàn)3個(gè)主要的熒光信號(hào)，清晰定位于第一對(duì)中部著絲粒染色體(M1)的端部區(qū)域。

綜上所述,通過銀染、CMA3DA/DAPI三重?zé)晒馊旧?、FISH定位在2n♀×3n♂和3n♀×2n♂后代中得到的 NORs 位點(diǎn)相吻合，位點(diǎn)數(shù)目最多為 3個(gè)。該結(jié)果表明，雜交三倍體泥鰍無論雌雄與二倍體泥鰍雜交所產(chǎn)生的后代染色體組構(gòu)成均為3套染色體組，進(jìn)而可推測(cè)雜交三倍體泥鰍無論雌雄均可產(chǎn)生(1.5～2)n配子，本研究結(jié)果為雜交三倍體泥鰍配子染色體組成提供了細(xì)胞遺傳學(xué)證據(jù)。