曹增梅，王偉偉，陳娟，王娜，曲艷艷，梁廣津

(山東東方海洋科技股份有限公司 國(guó)家海藻與海參工程技術(shù)研究中心， 山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 264003)

海藻營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，是人類重要的食物來(lái)源之一，因其含有的色素、脂肪酸、多糖、酚等活性物質(zhì)具有抗氧化、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能，已成為生產(chǎn)保健食品、水產(chǎn)飼料及藥品等重要的天然原材料[1-5]。中國(guó)海域廣闊，海藻資源豐富，現(xiàn)已形成包括水產(chǎn)養(yǎng)殖、藻膠工業(yè)、化工醫(yī)藥生產(chǎn)及化肥飼料工業(yè)等在內(nèi)的海藻生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)鏈[6]。目前，中國(guó)海藻產(chǎn)品總產(chǎn)量快速增長(zhǎng)，生產(chǎn)結(jié)構(gòu)正從品種單一向品種多樣化轉(zhuǎn)變，但其中仍是海帶產(chǎn)品“一家獨(dú)大”，其次是江蘺、裙帶菜、紫菜，而其產(chǎn)量均遠(yuǎn)低于海帶[7]。從海藻產(chǎn)業(yè)發(fā)展來(lái)看，還需在品種多樣性、產(chǎn)品功能性等方面深入開發(fā)，以促進(jìn)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整與升級(jí)。

游離氨基酸(free amino acids，F(xiàn)AA)以游離態(tài)形式存在于生物體中，是海藻重要的營(yíng)養(yǎng)成分之一，也是海藻呈現(xiàn)獨(dú)特風(fēng)味的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[8-11]。除了常規(guī)氨基酸種類外，海藻中還含有微量游離態(tài)的?；撬?、γ-氨基丁酸、羥(基)脯氨酸、瓜氨酸等非蛋白質(zhì)氨基酸活性成分[12]。有研究表明，游離氨基酸作為金屬自由離子的螯合劑為脅迫條件下的海藻提供保護(hù)[13]。游離氨基酸雖有著重要的生物學(xué)功能，但與海藻總氨基酸含量相比，這一營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)經(jīng)常被忽略，從而影響對(duì)海藻營(yíng)養(yǎng)的全面評(píng)價(jià)。綠藻(石莼Ulvalactuca)、紅藻(日本馬澤藻Mazzaellajaponica、石花菜Gelidiumamansii)和褐藻(海蒿子Sargassumpallidum)，是黃渤海沿岸常見(jiàn)的野生海藻種類，其中，石莼和海蒿子主要用于飼料、肥料、藥用和工業(yè)原料等，石花菜則是制造瓊膠的主要原料，日本馬澤藻可作為蔬菜食用[14]。本研究中，對(duì)這4種野生海藻游離氨基酸進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，旨在為反映其食用品質(zhì)與商業(yè)價(jià)值，以及為海藻新經(jīng)濟(jì)種類開發(fā)提供基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用海藻樣品均于2015年7月初采自山東

省榮成市寧津鎮(zhèn)楮島灣海域，海蒿子(整株粉碎，包含多年木質(zhì)莖和新生藻體)、日本馬澤藻和石花菜采自潮間帶，石莼采自海帶養(yǎng)殖筏架上。樣品經(jīng)過(guò)表面清理、晾曬、烘干、粉碎,過(guò)120目篩待用。

三氯乙酸、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、乙腈和甲醇等試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司，前3種為分析純，后2種為色譜級(jí)；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品、OPA購(gòu)自安捷倫公司，色譜級(jí)。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 游離氨基酸樣品處理參照 GB/T22729.5—2008的方法[15]。稱取0.2～0.4 g海藻樣品，加入10 mL 5%三氯乙酸搖勻，靜置2 h，加水定容至25 mL，混勻后取部分上清液于10 mL離心管，加入少許活性炭脫色，以12 000 r/min離心10 min，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，置于棕色進(jìn)樣瓶中，用于游離氨基酸的檢測(cè)。

1.2.2 游離氨基酸的高效液相色譜(HPLC)分析 色譜柱為 Agilent ZORBAX Eclipse AAA 4.6 ×150 mm；柱溫為40 ℃；熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm；流動(dòng)相A，40 mmol/L Na2HPO4用10 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.8；流動(dòng)相B，CH3CN∶MeOH∶H2O=45∶45∶10(體積比)；流速為2 mL/min。采用Agilent 1260HPLC自動(dòng)進(jìn)樣器，對(duì)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的氨基酸進(jìn)行OPA在線衍生，采用安捷倫公司提供的快速、準(zhǔn)確、靈敏、重現(xiàn)性好的HPLC氨基酸分析方法，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品及樣品進(jìn)行16種氨基酸的檢測(cè)。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)中所有測(cè)定數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)和Tukey多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻游離氨基酸含量比較

本研究中檢測(cè)到的海藻氨基酸種類包括蘇氨酸(Thr)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)、異亮氨酸(Ile)和亮氨酸(Leu) 7種必需氨基酸(essential amino acids，EAA)，以及組氨酸(His)、精氨酸(Arg)、天門冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、酪氨酸(Tyr)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)和胱氨酸(Cys)9種非必需氨基酸(non-essential amino acids，NEAA)。由于方法的限制未能檢出色氨酸(Try)，氨基酸的HPLC分析圖譜見(jiàn)文獻(xiàn)[16]。游離氨基酸含量(FAA)以16種氨基酸的總和計(jì)。4種野生海藻游離氨基酸含量比較見(jiàn)圖1。游離氨基酸含量排序以日本馬澤藻最高(8.50 mg/g)，其次是海蒿子(7.45 mg/g)和石花菜(6.84 mg/g)，石莼最低(4.45 mg/g)。4種海藻的游離氨基酸含量相互間有顯著性差異(P<0.05)。

注：標(biāo)有不同小寫字母者表示海藻間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，下同Note: The means with different letters are significant differences among seaweeds at the 0.05 probability level, and the means with the same letters are not significant differences among seaweeds, et sequentia圖1 4種海藻的游離氨基酸含量Fig.1 Contents of free amino acids in four species of wild seaweeds

2.2 海藻游離氨基酸組成分析

從圖2可見(jiàn)：4種海藻的游離氨基酸組成明顯不同，石莼、日本馬澤藻和石花菜分別以His、Ala和Glu為主，占游離氨基酸的比例分別為55.77%、67.66%、54.93%;Glu在石莼、日本馬澤藻中的含量也較豐富，比例分別為15.68%和15.39%,除Glu外，石花菜中Asp和Ala含量也較高，其比例分別為14.85%和11.93%；不同于其他3種海藻以單一氨基酸為主，海蒿子的Glu、Asp和Ala的比例分別為28.12%、26.46%、19.82%；其余氨基酸在4種海藻中所占比例均較低，其中，Val和Phe在石莼中，Phe在石花菜中未被檢出。

2.3 海藻呈味氨基酸組成特征

游離氨基酸是海藻重要的風(fēng)味物質(zhì)。對(duì)4種海藻的呈味氨基酸分析結(jié)果表明：日本馬澤藻呈味氨基酸以甜味氨基酸(Ser+Gly+Ala)為主，其他3種藻均以鮮味氨基酸(Glu+Asp)為主(圖3)。日本馬澤藻呈味氨基酸的含量最高(7.60 mg/g)，且顯著高于其他3種海藻(P<0.05)；石花菜和海蒿子的含量分別為6.14、5.75 mg/g，二者無(wú)顯著性差異(P>0.05)，石莼僅為1.40 mg/g。

就呈味氨基酸占游離氨基酸的比例而言，紅藻日本馬澤藻和石花菜呈味氨基酸的比例分別高達(dá)89.37%、89.71%，顯著高于海蒿子(77.13%)和石莼(31.53%)(P<0.05)(表1)。

圖2 4種海藻的游離氨基酸組成Fig.2 Compositions of free amino acids in four species of wild seaweeds

圖3 4種海藻呈味氨基酸含量Fig.3 Contents of flavor amino acids in four species of wild seaweeds

2.4 海藻游離必需氨基酸組成特征

從圖2可見(jiàn)，4種海藻的游離必需氨基酸含量較低，且組成明顯不同。石莼以Met和Thr為主，二者占必需氨基酸的比例為77.65%；日本馬澤藻中Val、Met和Thr豐富，其比例分別為24.14%、23.80%、20.56%；石花菜中Met占必需氨基酸的比例為50.50%，Thr占24.49%；海蒿子中游離必需氨基酸以Leu最為豐富(29.29%)，其次是Val(26.39%)和Met(25.09%)。4種海藻游離Lys含量較豐富。游離必需氨基酸含量以日本馬澤藻最高(0.78 mg/g)，海蒿子次之(0.69 mg/g)，石莼最低(0.34 mg/g)，海藻間含量差異較大。但必需氨基酸占總游離氨基酸的比例無(wú)顯著性差異(P>0.05)(圖4)。

圖4 4種海藻必需氨基酸含量占游離氨基酸的比例Fig.4 Contents of free EAA and percentages in free amino acids in four species of wild seaweeds

3 討論

3.1 海藻游離氨基酸的影響因子

游離氨基酸是海藻中的重要風(fēng)味物質(zhì)和生物活性成分，發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。從海藻游離氨基酸比較結(jié)果(表1)來(lái)看，不同海藻的游離氨基酸含量差異較大，即使是同一種海藻，如海蒿子和羊棲菜，因采樣點(diǎn)等因素不同其含量相差可達(dá)到1個(gè)數(shù)量級(jí)[12]。除了物種本身帶來(lái)的游離氨基酸含量差異外，還有季節(jié)變化、海水營(yíng)養(yǎng)條件和氨基酸分析方法等多種因素造成海藻間游離氨基酸的差異。如在海帶和條斑紫菜中發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)月份和采收時(shí)間不同使其游離氨基酸含量和組成明顯差異[16-17]；低氮、磷脅迫會(huì)使壇紫菜葉狀體的游離氨基酸含量明顯降低，氨基酸種類組成顯著變化[18]，反之，培養(yǎng)基增加氮+磷營(yíng)養(yǎng)鹽或深海水明顯促進(jìn)條斑紫菜和孔石莼游離氨基酸含量的增加[19-20]；有效樣品處理方法與分析方法也會(huì)促進(jìn)海藻中色氨酸、?；撬?、γ-氨基丁酸、瓜氨酸等游離態(tài)氨基酸的檢出[11-12,21]，提高氨基酸營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)的可靠度。

3.2 海藻游離氨基酸組成的比較

對(duì)游離氨基酸組成以及呈味氨基酸、必需氨基酸所占比例(表1)分析發(fā)現(xiàn)，海藻間的游離氨基酸組成差異明顯。從游離氨基酸組成來(lái)看，Glu、Ala是主要組成種類，Asp、Pro和Arg的比例在一些海藻中也較高，這是海藻呈現(xiàn)獨(dú)特風(fēng)味的重要原因；此外，有些藻類游離氨基酸中必需氨基酸或半必需氨基酸的含量也較豐富，如本研究中石莼的His比例達(dá)到55.77%，Lys在本次采集的4種海藻和野生壇紫菜[23]中含量豐富，Phe在V.lanosa、海蒿子、鼠尾藻等藻中占有較高的比例[11-12]。從分類氨基酸的比例來(lái)看，綠藻、紅藻和褐藻中除少量樣品其呈味游離氨基酸的含量較低外，海藻中呈味氨基酸是游離氨基酸的主要組成部分，但鮮味氨基酸和甜味氨基酸的比例因藻而異。相反，必需氨基酸在海藻游離氨基酸中的比例普遍較低，但在海帶、海蒿子、羊棲菜、鼠尾藻和野生壇紫菜等海藻樣品中比例較高，最高比例占游離氨基酸量的一半以上[12]。研究表明，海藻的游離必需氨基酸組成存在明顯的差異，而且許多海藻存在某些必需氨基酸種類缺乏甚至游離必需氨基酸全部未檢出的現(xiàn)象[11]。

表1 不同海藻游離氨基酸組成的比較Tab.1 Comparison of free amino acid composition in different species of seaweeds

綜上所述，針對(duì)海藻游離氨基酸的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值應(yīng)用有幾方面值得注意：首先，除海帶、紫菜等藻類的游離氨基酸含量較高外，海藻中的含量普遍較低，影響其后續(xù)開發(fā)利用；其次，海藻中的游離氨基酸多以呈味氨基酸為主，必需氨基酸的含量低或者缺乏某些氨基酸種類勢(shì)必會(huì)影響海藻的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)；最后，海藻游離氨基酸的含量與組成受到多種因素的復(fù)雜影響。基于游離氨基酸的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和重要生物學(xué)功能，高游離氨基酸含量和全面均衡營(yíng)養(yǎng)將是海藻新經(jīng)濟(jì)品種開發(fā)的一個(gè)重要方向。