潘奕如,曹景龍,王靜遠,黎潔、3

(1.華中農業(yè)大學 水產學院，湖北 武漢 430070;2.華中農業(yè)大學 水產養(yǎng)殖國家級實驗教學示范中心，湖北 武漢 430070;3.池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實驗室，湖北 武漢 430070)

核酸擴增技術，主要指聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)，自1985年首次出現(xiàn)，即被廣泛應用于以分子生物學為基礎的醫(yī)學、生物學等領域中,其也是魚類養(yǎng)殖生產中減少經濟損失、防止病害蔓延的一種有效快速檢測技術。目前，應用于魚類病原菌檢測的分子診斷技術，如PCR和RT-PCR技術(Reverse transcription-polymerase chain reaction)等均具有較高的特異性和敏感性。但由于其對高精密的熱循環(huán)儀器及成像系統(tǒng)的依賴，并存在反應步驟復雜、時間較長等缺點，相關學者一直致力于分子診斷技術的改進和優(yōu)化。2000年， Notomi等[1]公開了一種適用于核酸檢測的環(huán)介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，迅速引起了人們的關注，它針對目標DNA鏈上的6個區(qū)段設計4條不同的引物，在BstDNA聚合酶的催化作用下通過鏈置換反應在一定溫度下快速擴增目的片段。該技術僅利用一個加熱設備或者恒溫水浴鍋維持一定溫度即可進行反應，相對于傳統(tǒng)PCR和RT-PCR反應來說具有更高的靈敏度和特異性，對于檢測結果的觀察也更為直觀。目前，LAMP已經被廣泛應用于人類和動物病原生物的檢測，如SARS冠狀病毒(SARS-CoV)[2]、H5N1禽流感病毒(H5N1 Avian Influenza viruses)[3]、口蹄疫病毒(Footandmouth disease virus, FMDV)[4]、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)[1]等。在水產動物病原的檢測方面，LAMP也已得到廣泛的應用，如病毒中的虹彩病毒(Iridovirus)[5-6]、皰疹病毒(Herpesvirus)[7-10]等，細菌中的愛德華氏菌屬Edwardsiella[11-12]、弧菌屬Vibrio[13-15]，寄生蟲中的黏孢子蟲屬Myxosporea[16-17]、華支睪吸蟲Clonorchissinensis[18-19]等，并取得了良好的效果。本研究中，對2004年以來國內外學者建立的LAMP法在水產養(yǎng)殖動物常見病原生物快速檢測中的應用及對該技術的改進進行簡要概述，旨在為該技術在生產一線的應用和推廣提供參考。

1 LAMP方法簡介

LAMP技術是一種能在等溫條件下，利用一組4條特異性引物對極少量的目的DNA片段進行高效、快速和特異性擴增的核酸擴增技術。成環(huán)擴增反應能夠在1 h內將目的片段的數(shù)量累積到109～1010倍。4種引物分別針對特定片段的6個區(qū)段(F3、F2、F1、B1、B2和B3)設計，其中正向內引物FIP(Forward insert primer)包括F2和F1c(與F1序列互補)兩段序列，反向內引物BIP(Backward insert primer)則包括B2和B1c兩段序列(圖1)。在起始反應中，4種引物均發(fā)揮了作用，在隨后的成環(huán)反應中則主要是由內引物完成鏈置換和鏈合成過程。由于FIP和BIP均包含了目的片段正義鏈和反義鏈的兩段不同序列，一段序列用于第一階段的起始反應，另一段序列則用于隨后的自動成環(huán)反應。LAMP的最大特點是不需要使雙鏈DNA先變性成單鏈，在等溫條件下可持續(xù)進行擴增。對于RNA病毒，在反應體系中直接加入反轉錄酶就可以直接進行快速檢測。LAMP擴增的效率和靈敏度也較高，一般在恒定溫度下，1 h可以對拷貝的DNA進行109倍擴增[1]。經進一步優(yōu)化，在反應體系中直接加入環(huán)引物LF(Loop Primer Forward)、LB(Loop primer Backward)(這是一種雜交莖環(huán)結構)，能省略預變性的時間，使得反應時間縮短至0.5 h左右[20-23]。

圖1 LAMP引物示意圖Fig.1 Primer for LAMP method

1.1 引物設計原則

LAMP的引物可在引物設計網站導入靶基因設置相關參數(shù)獲得。其設計原則與PCR類似，但由于LAMP對引物的要求較高，所以較PCR更為復雜。引物的退火溫度(Tm)、引物末端的穩(wěn)定性、GC含量和引物的二級結構是其引物設計最關鍵的因素。引物的Tm值通過緊鄰分析法估算，一般要求F1c和B1c的Tm值為64～66 ℃；F2、F3、B2、B3的Tm值為59～61 ℃，即二者溫差為5 ℃較好，環(huán)引物的Tm值同F(xiàn)1c和B1c。引物末端的穩(wěn)定性由自由能改變值(△G)來衡量，一般要求F2、B2、F3、B3的3′端和F1c、B1c的5′端的△G小于或等于-4 Kcal/mol。此外，當引物的GC含量為50%～ 60%時，質量較高，根據(jù)實際情況將條件適當放寬至40%～65%也可。另外，設計的引物自身或引物間要求不能形成二級結構。對于引物間的距離也有要求，F(xiàn)2末端和B2末端的區(qū)域應介于120～160 bp，F(xiàn)2的5′端和F1的5′端間成環(huán)區(qū)域的間距為40～60 bp，F(xiàn)2到F3間的距離為0～60 bp(B2同B3)。此外，由于鏈的取代反應是限速步驟之一，因此，要求目的片段小于300 bp。

1.2 反應條件

一般來說，LAMP方法的建立涉及到引物及其濃度、反應溫度、反應時間、Mg2+最適濃度等反應條件的優(yōu)化。引物的最適比例需要通過具體試驗確定，一般內引物、外引物、環(huán)引物的比例以8∶1∶4較為適合[21]，Zhang等[22]在蛙病毒屬Ranavirus的LAMP中發(fā)現(xiàn)，三者的最佳比例為10∶1∶5；Suebsing等[23]使用10∶1∶10的比例檢測大馬哈魚Oncorhynchusketa傳染性造血器官壞死病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV)也收到了較好的效果。一般來說，其他兩對引物比例不變的條件下，適當增加內引物的濃度，可以提高反應的靈敏度，而外引物的濃度增加則對靈敏度無明顯的影響[24]。

反應條件中Mg2+的濃度也是非常關鍵的一個因素，在眾多已建立的LAMP檢測方法中，Mg2+較為常見的終濃度為6 mmol/L，效果最好[23]，也有報道認為，體系中Mg2+的終濃度為8 mmol/L[25]和10 mmol/L[26]時產物的條帶更為清晰。

此外，也有學者研究在內引物F1c(B1c)與F2(B2)之間分別插入2、4、6個T作為連接子，比較其對反應結果的影響[27]，結果表明,插入4個T和6個T均能完成反應，其中，4個T的插入使得目的產物的條帶比不插入任何堿基時更清晰，Jeon等[17]的研究也證實了這一點，而2個T的插入可能抑制成環(huán)過程，導致反應不能正常進行。

1.3 產物的檢測

作為一種核苷酸的擴增反應，LAMP無疑可采用瓊脂糖凝膠電泳進行分析，可以通過是否在理論位置產生有梯度的條帶來判斷靶基因是否存在，另外，有無雜帶和引物二聚體還可作為引物的評判標準。此外，LAMP還有許多更為直觀簡便的方法來檢測產物。

在LAMP反應過程中，焦磷酸離子從dNTPs中釋放后與Mg2+結合形成焦磷酸鎂沉淀(Mg2P2O7)，此衍生物與生成的反應擴增產物成正比，與病原的DNA拷貝數(shù)也具有顯著的相關性[28]，隨著反應產生大量的擴增產物，衍生物的產量也會增加，直至出現(xiàn)白色渾濁，可通過肉眼觀察反應管中白色沉淀的有無來判斷病原是否存在，免去了瓊脂糖凝膠電泳檢測，也有研究使用濁度儀來檢測反應管的濁度。

單憑肉眼或分光光度計來分辨濁度變化并不直觀，輕度的陽性反應有可能會被誤認為是陰性。因此，關于結果判斷，學者們希望找到更為直觀有效的方法。例如，在LAMP反應結束后加入DNA插入染料，如SYBR green、picogreen或 propidium iodide。其中SYBR green使用較為廣泛，該染料能與所有dsDNA雙螺旋的小溝區(qū)域結合，結合后原來游離狀態(tài)下的微弱熒光瞬間增強，可以指示反應體系中的擴增產物形成與否。近年來，用FITC(Fluorescein isothiocyanate)標記雜交探針與生物素標記的擴增產物進行特異性雜交，通過橫向流動試紙(Lateral flow dipstick，LFD)判讀結果的環(huán)介導等溫擴增聯(lián)合橫向側流試紙法(LFD-LAMP)也得到越來越多的應用。即以擴增的目標片段中的一段序列作為模板，設計異硫氰酸熒光素(FITC)探針，或用FITC標記環(huán)引物(LP或者LB)的其中一條作為探針，利用試紙檢測線上抗FITC抗體是否與FITC標記的擴增產物結合引起顯色反應來指示目標片段存在與否和是否發(fā)生擴增[24]，并用生物素標記內引物的5′端，作為質控的顯色標記。如嗜水氣單細胞菌Aeromonashydrophila的快速檢測[29]和傳染性脾腎壞死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)的檢測[30]等，后者全程僅需25 min，最低檢測濃度為10個拷貝/反應，其靈敏度和反應速度均優(yōu)于常規(guī)的PCR反應。

以上方法均需要在反應結束后開蓋檢測，因此，都有被污染的風險。2013年，Suebsing等[31]在建立的海豚鏈球菌Streptococcusiniae和無乳鏈球菌S.agalactiae的LAMP檢測中，在反應前預先加入終濃度為25 μmol/L的鈣黃綠素染液，實現(xiàn)了不開蓋顯色檢測，避免了開蓋后的氣溶膠污染。反應前，染液中的Mn2+與鈣黃綠素結合處于淬滅狀態(tài)呈橘黃色，一旦LAMP反應觸發(fā)后，錳離子與擴增產物的副產物焦磷酸鎂發(fā)生置換，焦磷酸離子與錳離子結合形成難溶的焦磷酸錳沉淀，鈣黃綠素得到釋放，淬滅狀態(tài)解除，發(fā)出黃綠色熒光?？梢酝ㄟ^肉眼進行比較，判斷出擴增結果，在較大程度上避免了開蓋造成的假陽性污染。

1.4 避免假陽性的方法

由于LAMP技術1 h就能對拷貝的DNA進行109倍擴增，從而使操作過程中稍有不當即易產生氣溶膠污染，最終導致假陽性結果的出現(xiàn)，影響實際生產與應用。避免假陽性的方法有兩種：一是閉管檢測，防止產物形成氣溶膠；二是降解氣溶膠上的產物。對于第一種方法應用較為廣泛的是檢測產物渾濁度或通過鈣綠黃素染液顯色實現(xiàn)不開蓋檢測。第二種方法主要是在反應體系中引入dUTP進行預擴增，并加入有效的尿嘧啶核苷酸(UNG)降解含有dUTP的擴增產物，能有效防止遺留物的污染[32]，此說法在不少文獻中得到了驗證[33-34]。

2 LAMP技術在水產病害中的應用

2.1 LAMP技術在病毒檢測中的應用

2.1.1 對蝦白斑綜合癥病毒的檢測 對蝦白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)是一種具有囊膜、無包涵體的桿狀DNA病毒，毒力極強。1992年的研究發(fā)現(xiàn)，此病毒主要引起蝦的頭胸甲、皮下和附肢出現(xiàn)白色斑點，1993年研究發(fā)現(xiàn)，此病毒引起的對蝦暴發(fā)性流行病給亞洲對蝦養(yǎng)殖產業(yè)造成了巨大沖擊[35]。由于缺乏特異性免疫應答機制，因此，通過早期診斷技術篩選健康親蝦，切斷病原垂直傳播或培育抗病原的新品種對于蝦病防治尤為重要。2004年，Kono 等[36]基于WSSV全DNA序列創(chuàng)建了在65 ℃、60 min條件下快速檢測對蝦白斑綜合征病毒的LAMP方法，給該病毒的早期快速診斷帶來了福音。2011年，馮華等[37]對于該方法的研究表明，LAMP檢測的敏感性顯著高于巢式PCR。隨后，Chou等[38]將LAMP技術與熒光共振能量轉移技術(Fluorescent resonance energy transfer，F(xiàn)RET)結合對WSSV的LAMP檢測方法進行了優(yōu)化，有效提高了檢測的特異性。何琳[34]在后期的研究中不僅對反應條件重新進行了優(yōu)化，建立了WSSV和傳染性皮下和造血組織壞死病毒(Infection hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV)多重檢測技術，同時先后在反應體系中引入dUTP 和UNG酶來消除LAMP技術的假陽性現(xiàn)象，也能有效地避免反應過程中的污染。

2.1.2 水生呼腸孤病毒的檢測 水生呼腸孤病毒(Aquareovirus，ARV)是一類感染水生生物的呼腸孤病毒，主要通過呼吸器官和腸道感染宿主，能引起肝胰臟疾病及出血病癥，給水產養(yǎng)殖業(yè)帶來了不可估量的損失[39]。草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)是中國分離鑒定的第一株魚類病毒，同時也是對草魚Ctenopharyngodonidellus危害非常大的一株病毒，可能會引起草魚出血病的暴發(fā)。Zhang等[40]通過往反應體系中直接加入反轉錄酶建立了GCRV的RT-LAMP(Reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification)檢測方法，并對Mg2+濃度、反應溫度、時間等反應條件進行了優(yōu)化，結果比傳統(tǒng)RT-PCR靈敏度更高。2013年，Zeng等[41]又基于GCRV的s6基因設計了包括兩條環(huán)引物的6條RT-LAMP引物，環(huán)引物的加入進一步縮短了檢測過程，40 min即可完全反應，檢測的最低濃度為10個拷貝/μL，比RT-PCR高出10個數(shù)量級，且準確性也比RT-PCR要高。2011年，Chen等[42]建立了泥蟹鋸緣青蟹呼腸孤病毒(Scylla serrata reovrirus，SSRV)的LAMP快速檢測方法，該方法在62 ℃、60 min條件下靈敏度可達0.8 fg/反應，比傳統(tǒng)的RT-PCR高出1000倍。2016年，Ma等[43]又對中華絨螯蟹呼腸孤病毒(Eriocheir sinensis reovirus，ESRV)建立了LAMP檢測法，在65 ℃恒溫條件下僅需45 min即可檢測出病原，靈敏度為15 fg/反應，也比傳統(tǒng)RT-PCR反應高出了100倍。

2.1.3 虹彩病毒的檢測 虹彩病毒(Iridovirus)是一種胞漿型DNA病毒，主要引起魚類和蛙類等動物的疾病。對該病毒的LAMP研究最早出現(xiàn)在2004年，Caipang等[28]針對真鯛科魚類中的虹彩病毒(RSIV)建立的LAMP檢測法，發(fā)現(xiàn)其靈敏度比常規(guī)PCR反應高10倍。2008年，Mao等[6]應用LAMP技術對新加坡石斑魚虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus，SGIV)進行快速檢測，結果表明，在65 ℃、20 min水浴條件下最低檢測限度為0.02 fg(6.3拷貝數(shù))/反應。2009年，Zhang等[5]基于MspI限制性DNA片段對新發(fā)現(xiàn)的病毒——大菱鲆紅體病虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus，TRBIV)建立了快速檢測方法，該方法靈敏度是常規(guī)PCR反應的100倍。2016年，Suebsing等[44]基于一種主要的衣殼蛋白基因建立了羅非魚Oreochromisspp.傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)的羥基萘酚藍-LAMP法，研究ISKNV在羅非魚體內的轉移。該方法的最佳反應條件為65 ℃、45 min，其能通過顏色的變化特異性檢測到病原菌，在ISKNV感染的羅非魚池塘中病原檢出率比普通PCR反應高出41.33%。紅色羅非魚O.niloticus×O.mossambicus的原位LAMP試驗結果顯示，ISKNV存在于生殖腺中，陽性信號僅存在于卵泡中，卵母細胞中并沒有，而組織趨向性試驗結果表明，腦是ISKNV在紅色羅非魚(40%)和尼羅羅非魚O.niloticus(20%)中感染的主要靶器官。

虹彩病毒中的大鯢蛙病毒(Ranavirus)是一種新型病原微生物，表現(xiàn)為大鯢Andriasdavidianus體表出現(xiàn)潰爛并出現(xiàn)血紅色斑點。2013年，Zhang等[22]建立了蛙病毒屬的LAMP檢測方法，能夠成功檢測出大鯢虹彩病毒(Andrias davidianus iridovirus，ADIV)、中華鱉虹彩病毒(Soft-shelled turtle iridovirus，STIV)和流行性造血器官壞死病毒(Epizootic hematopoietic necrosis virus，EHNV)，且對錦鯉皰疹病毒(Koi herpes virus，KHV)、斑點叉尾鮰病毒(Channel catfish virus，CCV)、傳染性肝腎壞死病毒(ISKNV)和白斑綜合征病毒(WSSV)等無交叉反應，最低檢測濃度為100個拷貝數(shù)/μL的STIV病毒DNA片段，靈敏度比普通PCR反應高10倍。2014年，劉星星等[45]建立和優(yōu)化了大鯢蛙病毒LAMP方法，在62 ℃、40 min水浴條件下即可完成反應，且優(yōu)化反應體系后的LAMP比巢式PCR最低檢出率高1個數(shù)量級，比普通PCR高3個數(shù)量級，特異性強且與多種病毒均無交叉反應。

2.1.4 彈狀病毒的檢測 彈狀病毒科Rhabdoviridae的病毒粒子形態(tài)似棒狀或子彈狀，病毒在細胞質內增殖，鯉春病毒血癥病毒(Spring viraemia of carp virus，SVCV)、病毒性出血性敗血癥病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus，VHSV)、傳染性造血器官壞死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV)均屬于此類病毒。

Gunimaladevi等[46]在2005年基于G蛋白基因同時建立了虹鱒Oncorhynchusmykiss傳染性造血壞死病毒的RT-LAMP和LAMP檢測方法。結果表明，在63 ℃、60 min 條件下RT-LAMP與LAMP的結果類似，靈敏度均比傳統(tǒng)巢式PCR高出10倍。2011年，Suebsing等[23]基于同一個基因建立了大馬哈魚該病毒的快速檢測方法，由于環(huán)引物的作用，該方法30 min內即可檢測到IHNV的擴增產物。檢測限度為0.01 fg/μL，同樣比巢式RT-PCR高出10倍，且在473份樣品中，RT-LAMP的陽性檢出率為40.38%，而RT-PCR的檢出率為34.25%。病毒性出血性敗血癥病毒的RT-LAMP檢測方法則于2006年被Soliman等[21]建立，環(huán)引物的加入使得反應時間由60 min縮短至30 min，值得一提的是，該反應的靈敏度與常規(guī)PCR反應一致。

2008年，Shivappa等[47]基于糖蛋白G的核苷酸序列建立了鯉春病毒的RT-LAMP法，連續(xù)稀釋SVCV 樣品的結果與RT-PCR相似，最低稀釋至10 TCID50/mL,同樣可以被檢測出。同年，Mao等[6]基于M基因建立了該病毒的一步式RT-LAMP檢測方法，靈敏度比RT-PCR反應高10倍，對472尾樣品魚的檢測結果表明，該方法與標準病毒分離方法的檢測結果一致。

2.1.5 皰疹病毒科的檢測 皰疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)的檢測方法有許多，如活細胞分離、電鏡掃描、PCR檢測、ELISA和原位雜交等，但均耗時耗力，且對設備的要求非常高。2004年，Gunimaladevi等[7]基于胸苷激酶基因(tk)序列建立了鯉CyprinuscarpioL.錦鯉皰疹病毒(KHV)的LAMP檢測方法，最適反應條件為65 ℃、60 min，靈敏度與普通PCR一致，能從患病魚的鰓、肝和腎臟組織中檢測到病毒，而普通PCR則僅能從鰓組織中檢測到病毒。2005年，Soliman等[48]比較了該病毒感染后的組織經不同的處理方法對檢測結果的影響，發(fā)現(xiàn)該方法對沸煮法提取的DNA同樣適用。2009年，Yoshino等[8]也對該病毒的LAMP檢測方法開展了相關研究。

隨著時間的推移，鯉科皰疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)和3型(Cyprinid herpesvirus-3，CyHV-3)的LAMP檢測法也相繼被建立。2013年，He等[9]基于末端酶基因建立了金魚CyHV-2的LAMP檢測法，該方法檢測的最低核酸濃度為1.09×10-4μg/μL，高于常規(guī)PCR和實時熒光定量PCR試驗。異育銀鯽Carassiusauratusgibelio中該病毒的LAMP檢測法于2014年分別由中國水產科學研究院長江水產研究所Zhang等[49]、Liang等[10]基于DNA解旋酶基因和ITP基因建立，后者能檢測到10個拷貝/μL的病原，比PCR反應高出2個數(shù)量級，經過對120個異育銀鯽樣品檢測結果表明，陽性檢出率為92.5%，高于普通PCR試驗(70.8%)。2015年，Zhu 等[50]建立了異育銀鯽出血病病原(疑似CyHV-2)的LAMP檢測法，該方法能從流行地區(qū)無明顯癥狀的魚體內和患病魚卵中檢測到病原的陽性信號，提示該病原具有潛伏期且可能具有垂直傳播能力?？傊?，對于CyHV-2的LAMP檢測方法已非常成熟，可應用于批量檢測和早期診斷。

2009年，Soliman等[51]分別引入免疫捕捉(Immuno capture，IC)和直接結合(Direct bonding，DB)技術建立了CyHV-3的IC-LAMP和DB-LAMP檢測法，兩種方法均能成功檢測到病原的陽性信號，DB-LAMP的最低檢測濃度為0.1 virus particles/mL，比IC-LAMP高10倍。相比較于常規(guī)PCR反應的5 h來說，DB-LAMP反應在90 min內即可完成。DB-LAMP簡便、快速且敏感，可應用于CyHV-3的野外診斷。2010年，Soliman等[52]基于TK基因建立了CyHV-3的RT-LAMP聯(lián)合核酸橫向側流法，該方法的最低檢測限度為10 fg DNA目的片段/反應，相當于30個基因組拷貝。其靈敏度與LAMP反應相當，但能在5 min內顯示結果，進一步節(jié)省了時間。

皰疹病毒科的淋巴腫瘤病毒(Lymphocystis disease virus，LCDV)的LAMP檢測法也同樣被建立。2010年，Li等[53]基于主要的衣殼蛋白基因建立了LCDV的LAMP檢測法，最低檢測濃度為15 fg/反應，與實時熒光定量PCR的最低檢測濃度接近，但比常規(guī)PCR高10倍，經過對109份臨床樣品檢測表明，該方法是一種快速便捷的LCDV野外診斷工具。2017年，Valverde等[54]基于MCP基因建立了LCDV-VII型的RT-LAMP檢測法，該方法能檢測到無病癥的病毒攜帶魚，最低檢測濃度為10個病毒DNA拷貝/反應。

2.1.6 Beta諾達病毒(神經壞死病毒)的檢測 羅氏沼蝦Macrobrachiumrosenbergii的白尾病是由諾達病毒(Macrobrachiumrosenbergiinoda virus，MrNV)和額外的小病毒(Extra small virus，XSV)共同造成的一種疾病，這種病的RT-LAMP快速檢測法在2006年被Pillai等[55]建立。該方法設計了內、外引物各一對用來檢測MrNV，由于XSV通常更易降解且感染劑量較小，因此，另外設計一對環(huán)引物用于加速對XSV的檢測。未加環(huán)引物的RT-LAMP法對MrNV的檢測靈敏度比RT-PCR高10倍，對XSV的檢測靈敏度沒有顯著差異。而加入環(huán)引物的RT-LAMP反應則能使XSV的檢測靈敏度提高至少10 000倍。

神經壞死病毒(Nervous necrosis virus，NNV)的魚類宿主較為廣泛，對該病毒的RT-LAMP檢測方法的研究也比較熱門，2009年至今，學者們先后從石斑魚Epinephelussp.、牙鲆Paralichthysolivaceus、七帶石斑魚E.septemfasciatus等魚類[27,56-58]中分離到該病毒，基于該病毒的衣殼蛋白編碼基因、RdRP基因建立了RT-LAMP檢測法。其中，Suebsing等[57]的方法靈敏度最高，分別比巢式RT-PCR和RT-PCR高100倍和10 000倍。該方法能特異性地檢測條紋鲹神經壞死病毒(Striped jack nervous necrosis virus，SJNNV)和赤點神經壞死病毒(Red-spotted grouper nervous necrosis virus，RGNNV)，其他病毒樣品均顯示陰性結果。2009—2011年對102尾牙鲆的檢測數(shù)據(jù)表明，RT-LAMP的NNV檢出率(53.9%)同樣高于巢式RT-PCR(33.8%)。Sung等[56]、Mekata等[58]、Hwang等[27]建立的RT-LAMP檢測法靈敏度略低，但仍高于或與巢式RT-PCR相當，但比起常規(guī)RT-PCR來說優(yōu)勢非常明顯，且在時間和試劑的消耗上更勝一籌。

2010年，Xu等[59]基于基因組RNA建立了卵形鯧鲹TrachinotusovatusRGNNV的LAMP法，靈敏度比巢氏PCR反應高100倍，能從出現(xiàn)典型病癥的患病卵形鯧鲹腦中檢測到病原信號。

2.1.7 雙RNA病毒的檢測 傳染性胰腺壞死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus，IPNV)是鮭鱒魚類的主要傳染病原之一[60]，大西洋鮭Salmosalar和大馬哈魚IPNV的檢測方法分別由相關學者于2009年[61]和2011年[62]建立，兩種方法的反應條件均為65 ℃，前者能從IPNV感染的大西洋鮭腎組織中檢測到該病毒，最低檢測濃度為0.001 fg RNA/反應，最適反應條件為60 min。后者在30 min內對IPNV感染的虹鱒性腺2期細胞的最低檢測濃度為0.075 TCID50/mL，比巢式RT-PCR反應高出100倍，對659份野外樣品檢測表明，RT-LAMP的檢出率(40.4%)也高于巢式RT-PCR(27.6%)。此外，建立大馬哈魚IPNV快速檢測法的Suebsing等[63]同年分別構建了虹鱒IPNV、造血性壞疽病毒(Hematopoietic necrosis virus，IHNV)和出血性敗血癥病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus，VHSV)3種病毒病的RT-LAMP檢測法。在2年的觀測期內，抽檢樣品中有53.5%的虹鱒經檢測為IPNV陽性，其他兩種病毒未被檢出。

2009年，Andrade等[64]基于衣殼蛋白基因建立了傳染性肌肉壞死病毒(Infectious myonecrosis virus，IMNV)的RT-LAMP聯(lián)合核酸橫向側流法(Reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification and nucleic acid lateral flow，RT-LAMP-NALF)，該方法靈敏度比RT-PCR和RT-LAMP法分別高出100倍和10倍，比巢式RT-PCR和實時RT-PCR分別降低了90%和99%。

2.1.8 其他病毒科的檢測 其他病毒科的檢測主要針對傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)和Fathead minnow nidovirus(FHMNV)兩種。2006年，Sun等[65]建立了IHHNV的LAMP檢測方法，可通過凝膠電泳檢測到5～500拷貝的片段，比普通PCR靈敏度高出100倍。劉淼等[60]在2010年根據(jù)該病毒保守性區(qū)域的非結構蛋白基因NS1設計引物，將靈敏度提高到100個拷貝/μL，高于普通PCR 1000倍。2011年，Arunrut等[66]又將橫向流試紙與LAMP技術結合到一起，從而明顯縮短了檢測時間，使得試驗時間僅需50 min。2014年，Zhang等[25]基于纖突蛋白基因建立了FHMNV的RT-LAMP檢測法，在63 ℃、40 min水浴條件下即可完成反應，最低檢測限度為5個病毒拷貝/反應，靈敏度比常規(guī)RT-PCR高出1000倍，樣品檢測結果表明，當魚組織中病原拷貝數(shù)達到4.7×1010個/mg時，即能被該方法檢測到。

2.2 LAMP技術在細菌檢測中的應用

2.2.1 弧菌屬的檢測 弧菌的菌體短小，彎曲成弧形，是一種革蘭氏陰性菌，同時也是引起魚類細菌性疾病的重要病原菌之一。其流行面積廣，發(fā)病率高，給養(yǎng)殖業(yè)造成了極大危害，LAMP方法在弧菌的檢測上應用最為廣泛。

2009年和2010年，學者分別基于Ompk基因[67]和gyrB基因[13]建立了溶藻弧菌V.alginolyticus的LAMP檢測法，后者的最低檢測濃度為3.7 CFU/反應。2015年，Plaon等[68]基于rpoX基因設計目的片段，建立了該菌的LFD-LAMP檢測方法，在5 min內即可完成檢測，進一步避免了假陽性污染并縮短了檢測時間。

Yamazaki等[69]在2008年第一次將LAMP方法應用于副溶血弧菌V.parahemolyticus的檢測中，對養(yǎng)殖對蝦樣品進行檢測后發(fā)現(xiàn)，LAMP對組織中副溶血弧菌的最低檢測限度為2.0 CFU/反應，高出PCR的10倍。2014年，Zeng等[70]又將免疫磁化分離(Immunomagnetic separation，IMS)技術與LAMP技術相結合，利用磁性納米粒子攜帶的單克隆抗體捕獲靶細胞，進行非特異性結合使得檢測靈敏度大大提高。

LAMP技術在創(chuàng)傷弧菌快速檢測中的應用始于2008年，Han等[71]研究發(fā)現(xiàn)，在該菌感染的牡蠣Ostreagigas組織勻漿中檢測到的最低濃度約為107CFU/g，經過5 h的濃縮后可將濃度降低至7 CFU/g，這種檢測方法是PCRs靈敏度的1000倍。在此基礎上，2010年Han等[72]將普通LAMP改進為了實時定量檢測，通過熒光與渾濁度的方法同時進行結果判讀。為了提高檢測效率，2016年，Wang等[73]分別基于toxR基因與rpoS基因建立了雙重核酸限制性內切酶實時LAMP技術(Multiple endonuclease restriction real-time loop-mediated isothermal amplification technology，MERT-LAMP)對副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌V.vulnificus同時進行快速檢測。同年，Zhou等[74]分別基于魚腸道弧菌V.ichthyoenteri的ToxR基因、副溶血弧菌的OmpA基因、大菱鲆弧菌V.scophthalmi的luxR基因、創(chuàng)傷弧菌的金屬蛋白酶基因，設計了4組內引物含有不同限制性位點的特異性引物，建立了4種弧菌的四重LAMP檢測法，靈敏度比常規(guī)PCR方法高出100～1000倍。

除上述較常見的弧菌外，貝類動物哈維氏弧菌V.harveyi的LAMP檢測方法由Cao等[75]在2010年建立，大菱鲆弧菌V.scophthalmi的LAMP快速檢測方法由高志鑫等[76]在2015年建立，特異性均較強，與其他弧菌均無交叉反應。后者更是在30 min內即可完成反應。

2.2.2 鏈球菌屬的檢測 鏈球菌Streptococcus是一種革蘭氏陽性球菌，對水產養(yǎng)殖業(yè)的危害極大，鏈球菌病主要是由無乳鏈球菌S.agalactiae和海豚鏈球菌S.iniae[77]引起。在養(yǎng)殖羅非魚中對于海豚鏈球菌的LAMP檢測技術最早由Han等[72]于2011年基于pgm基因建立，隨后Cai等[78]和鄭磊等[79]均開展了羅非魚中該菌的LAMP研究，后者選擇cfb基因作為目的基因，靈敏度高達30 CUF/mL，是快速診斷羅非魚無乳鏈球菌的有效途徑。2013年，Suebsing等[31]預先加入鈣黃綠素建立了海豚鏈球菌和無乳鏈球菌的不開蓋快速比色LAMP法，王瑞娜等[80]也在該菌的LAMP檢測法中增加了橫向流動試紙條技術，這些優(yōu)化均能較好地避免開蓋對試驗結果造成假陽性污染。紅尾皇冠魚Aequidensrivulatus無乳鏈球菌的LAMP檢測方法則由姚學良等[81]在2014年基于cfb基因建立，同樣具有較高的特異性和穩(wěn)定性。

2.2.3 氣單胞菌屬的檢測 氣單胞菌Aeromonas是一種需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性短桿菌，兩端鈍圓，具單極鞭毛，通常嗜水氣單胞菌A.hydrophilia在水產病害中較為常見。程天印等[82]在2007年基于嗜水氣單胞菌氣溶素基因aerolysin的序列設計引物建立了相應的LAMP檢測法，該反應在63 ℃水浴條件下需要90 min完成擴增。同年，匡燕云[83]建立的該菌的LAMP檢測法，其目的基因的最低檢測限度為38 fg/反應，比普通PCR反應高1000倍，且通過設計并加入環(huán)引物，將反應時間縮短至30 min。為了避免開蓋檢測造成的假陽性污染，蔡怡等[29]又將環(huán)介導等溫擴增聯(lián)合橫向測流試紙(LAMP-LFD)應用于嗜水氣單胞菌的檢測中，使LAMP擴增到LFD結果判讀只需要40 min。2014年，李嘉彬等[84]又分別建立了嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌A.sobria的快速檢測方法，最低檢測限度依次為46、320 fg/mL，是普通PCR方法的10000倍和100倍。此外， 2013年，王子浩[33]建立了維氏氣單胞菌A.veronii的LAMP方法，在63 ℃、40 min水浴條件下即可完成反應，模板的最小檢測濃度為1.8 fg/μL，人工攻毒后4 h用LAMP檢測法即能在患病魚組織中檢測到病原菌，而PCR則需6 h才能檢測到。同時該方法也提出可通過分區(qū)操作、輕微操作和使用尿苷酸等方法來避免氣溶膠的污染。

2.2.4 愛德華氏菌的檢測 愛德華氏菌屬Edwaradsiella是最早運用LAMP方法進行檢測的一類魚類病原生物。2004年， Savan等[11]首次將這一方法應用到魚類遲緩愛德華氏菌E.tarda的檢測中來，該方法在65 ℃、45 min水浴條件下即可擴增出相應產物，最低可檢測出6個DNA拷貝/反應。2013年，Xie等[26]又基于hlyb基因的上游序列建立了該菌的LAMP檢測法，能檢測的最低濃度為10 CFU/反應，且與同屬其他愛德華氏菌不存在交叉反應。

2005年，Yeh等[12]基于eipl8基因建立了斑點叉尾鮰Ictaluruspunctatus愛德華氏菌屬的LAMP檢測方法，檢測的最低濃度為20 CFU/反應，能從患病魚的腦組織檢測到病原菌。

2.2.5 其他病原菌的檢測 除了上述列出的病原菌，目前已建立LAMP檢測方法的還有諾卡氏菌Nocardiaseriolae[85]、柱狀黃桿菌Flavobacteriumcolumnare[86]、噬冷黃桿菌F.psychrophilum[87]、鮭腎桿菌Renibacteriumsalmoninarum[88-89]、魯氏耶爾森氏菌Yersiniaruckeri[90]、弗朗西斯菌Francisellapiscicida[91]、惡臭假單胞菌Pseudomonasputida[92]和魚類格氏乳球菌Lactococcusgarvieae[93]等。其中，F(xiàn)ujiwara-Nagata等[87]在噬冷黃桿菌的LAMP檢測中發(fā)現(xiàn)，反應完成時間與病原菌拷貝數(shù)具有明顯的相關性。Gahlawat等[89]用LAMP同樣能檢測到qPCR顯示陽性的感染S.salmoninarum的虹鱒巨噬細胞和腎臟組織中的病原菌，靈敏度比qPCR高出一個數(shù)量級。Mao等[92]建立的P.putidaLAMP檢測法以rpoN基因為目的基因，其最低檢測限度為4.8 CFU/反應，能從其他9種革蘭氏陰性菌中特異性地鑒別出所有P.putida，也能從患病魚組織中檢測到病原菌的DNA片段。Tsai等[93]用LAMP檢測L.garvieae時發(fā)現(xiàn)，人工感染的羅非魚和鯔魚Mugilcephalus的脾、腎和腦組織中均能檢測到病原菌，此外，同時用細菌裂解物和純培養(yǎng)菌株的DNA作為模板，前者更能體現(xiàn)出LAMP相比較于PCR在靈敏度上的優(yōu)越性。

2.3 LAMP技術在寄生蟲檢測中的應用

寄生蟲也是危害生物安全的病原體之一，一般來說，PCR在DNA檢測寄生蟲中應用比較普遍。近年來，隨著LAMP技術的日趨成熟，腦黏體蟲Myxoboluscerebralis、黏孢子蟲Kudoaseptempunctata、日本血吸尾蚴SchistosomajaponicumKatsurada、貝類派琴蟲Perkinsusspp.和包納米蟲Bonamiaspp.、華支睪吸蟲等寄生蟲的LAMP檢測方法也相繼建立起來。

2005年，El-Matbouli等[94]基于18S rDNA基因建立了魚和寡毛類腦黏體蟲的LAMP檢測法，寄生蟲的DNA片段可在寡毛類、臀鰭、尾鰭、背鰭和鰓蓋的黏液中檢測到，該方法能檢測的最低限值與PCR反應接近，但更為快速和簡便。2005年，El-Matbouli等[16]基于SSU rDNA基因建立了能引起鮭鱒魚腎腫大病的黏孢子蟲新種K.bryosalmonae的LAMP檢測法，靈敏度比常規(guī)PCR反應高100倍。2014年，Jeon等[17]基于28S rDNA基因建立了褐牙鲆Paralichthysolivaceus黏孢子蟲的LAMP檢測法，反應條件為63 ℃、45 min，靈敏度比常規(guī)PCR反應高10倍。2015年，又一種寄生于褐牙鲆體內黏孢子蟲的LAMP檢測法和色譜分析法(Nucleic acid sequence based amplification-nucleic acid chromatography，NASBA-NAC)被Sugita-Konishi等[95]建立，結果表明，色譜分析法的靈敏度與定性PCR反應相當，而實時熒光LAMP則與實時熒光定量PCR相當。由于這兩種方法能在45 min內發(fā)生反應，因此，比其他檢測方法在時耗上更具優(yōu)勢。

尾蚴是日本血吸蟲的感染期，主要寄生在螺體內，對水生動物和人類危害極大。2008年楊秋林等[96]利用尾蚴鈣結合蛋白基因建立了一種可以快速且特異性檢測出日本血吸尾蚴的LAMP法。隨后，鄧鵬程[97]在此基礎上又建立了日本血吸蟲感染性釘螺、卡氏肺孢子蟲Pneumocystiscarinii、惡性瘧原蟲Plasmodiumfalciparum的環(huán)介導等溫擴增，敏感度分別是1 pg DNA/μL、1 pg DNA/μL和1.5個瘧原蟲/107RBC。

LAMP技術應用于魚類華支睪吸蟲的檢測始于2010年，由Cai等[18]建立的該方法在63 ℃、40 min水浴條件下即可完成擴增，在患病魚的腎和脾臟組織中均能檢測到病原，靈敏度為10-2fg/μL，比傳統(tǒng)的PCR反應高出100倍。2013年，Chen等[19]建立了寄生于淡水螺類的華支睪吸蟲的LAMP檢測法，該方法最低檢測濃度為10 fg/反應，比常規(guī)PCR反應高1000倍。

此外，王彩霞等[98]于2015年基于派琴蟲ITS基因序列和包納米蟲18S rRNA基因序列建立了貝類派琴蟲和包納米蟲的雙重LAMP檢測法，對兩種寄生蟲的最低檢測限度依次為10拷貝/μL和100拷貝/μL。2013年，Picón-Camacho等[99]基于SSUrDNA序列建立了卵圓鞭毛蟲Amyloodiniumocellatum的LAMP檢測法，62 ℃、25～30 min水浴條件下即能完成反應，能成功檢測到水體和魚鰓組織中的病原，最低檢測濃度為10 fg/反應，顯著高于常規(guī)的PCR反應(1 pg)。該方法還能檢測到單個的分裂前體和滋養(yǎng)體，對于卵圓鞭毛蟲病的早期預防和控制具有非常重要的意義。

3 發(fā)展現(xiàn)狀與前景

LAMP作為一種新型的核酸擴增技術，具有簡便、快速、準確、經濟等優(yōu)點，在未來發(fā)展前景十分廣闊。相比較于目前在水產類病害檢測中應用較廣且簡便、快速、特異性高的ELISA、斑點金免疫滲濾等免疫學診斷技術來說，LAMP能夠以指數(shù)形式對病原核酸序列大量擴增，在實際應用中能檢測出反應管中pg甚至 fg級別的微量核酸，進一步提高了反應的靈敏度。相對于需要高精度的熱循環(huán)儀器和成像系統(tǒng)的PCR和RT-PCR等技術，LAMP不需要昂貴的儀器和設備，僅通過恒溫水浴鍋在大約40 min內即可完成反應，甚至在某些野外簡陋條件下，利用保溫瓶也可粗略完成定性分析。這一優(yōu)勢在基層養(yǎng)殖場的應用中顯得尤為明顯，特別是在特異性和高靈敏度上的優(yōu)異表現(xiàn)，使其能夠實現(xiàn)對魚病的早期診斷，不僅能夠降低魚病監(jiān)測成本，同時還能有效地進行早期控制，避免魚類病害蔓延帶來的經濟損失。

然而，就目前的發(fā)展現(xiàn)狀而言，LAMP還存在諸多的不足。該方法只能檢測出是否擴增出DNA而不能判斷其是否為特異性擴增；LAMP為鏈置換合成，靶序列長度不宜過高，最好在300 bp以內，所以不能擴增較長的DNA鏈。此外，LAMP技術對病原的核酸數(shù)據(jù)量的需求和對引物的精準度方面提出了更高的要求。另一方面，水浴鍋同樣需要用電，且其熱穩(wěn)定性沒有PCR儀強，可能會導致試驗結果穩(wěn)定性不高，如需在野外條件下運用該方法，如何確保合適的反應溫度也是亟待解決的一個問題。

目前，市場已有許多基于LAMP技術的病原檢測試劑盒，如WSSV、RSIV、IHNV和KHV等，這些商業(yè)化試劑盒的出現(xiàn)也從另一個方面表明了該方法的有效性。此外，LAMP還可將耐藥基因作為目的片段，檢測耐藥病原菌，從而為進一步診斷和控制病害節(jié)省時間，盡可能減小疾病的傳播范圍。對于該技術的發(fā)展，其靈敏度過高易引起假陽性結果的弊端無疑是未來改良和優(yōu)化的一個主要方面，而進一步簡化組織樣品的處理過程，建立集樣品處理、反應和檢測3個步驟為一體的簡便、經濟的一次性套裝，可能更利于該技術在生產一線的應用和推廣，這也可能成為該技術的主要發(fā)展方向。