宋 暮，高 慧，董巧香*

(溫州醫(yī)科大學(xué) a檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，b公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，浙江 溫州 325035)

雌激素及孕激素是雌性動(dòng)物體內(nèi)重要的內(nèi)分泌激素，圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)期女性因體內(nèi)缺乏雌激素，將導(dǎo)致一系列生理及心理癥狀，如抑郁潮熱、泌尿生殖系統(tǒng)萎縮、骨質(zhì)疏松等。故而，臨床常用補(bǔ)充外源性雌激素來(lái)改善上述癥狀。目前研究對(duì)于激素替代療法增加乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌及卵巢癌等的風(fēng)險(xiǎn)處于爭(zhēng)議階段[1]。相關(guān)乳腺癌的統(tǒng)計(jì)學(xué)資料表示，乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與年齡密切相關(guān)，乳腺癌的發(fā)病人群主要為50歲以上的老齡女性，衰老能在某些程度上促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展[2]。

激素替代療法又名HRT，狹義的HRT即為雌激素替代療法，目前常用的雌激素替代療法包括單用雌激素、雌激素及孕激素序貫應(yīng)用、雌激素及孕激素連續(xù)應(yīng)用[3]等。因單用雌激素增加了子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)[4]，故此療法僅用于無(wú)子宮的老年女性。雌、孕激素序貫療法模擬正常生理周期，具有激素撤退性子宮出血等特點(diǎn)。而雌、孕激素連續(xù)應(yīng)用因避免了子宮周期性出血而被廣泛應(yīng)用，臨床調(diào)研表明，該法較其他療法增加了乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，長(zhǎng)期聯(lián)合應(yīng)用雌、孕激素增大了乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，且服藥時(shí)間越長(zhǎng)，風(fēng)險(xiǎn)越高[5]。與此同時(shí)，也有研究表明，激素替代療法對(duì)乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)被高估[5]。目前已有許多體內(nèi)及體外模型研究激素替代療法對(duì)雌性動(dòng)物乳腺上皮組織及乳腺癌細(xì)胞系的影響。雌激素及孕激素能夠促進(jìn)人乳腺組織增殖，其表達(dá)相關(guān)標(biāo)志物Ki67及增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)增加[6]。切除成年小鼠雙側(cè)卵巢構(gòu)建絕經(jīng)期動(dòng)物模型，經(jīng)雌激素療法后，其乳腺上皮增殖能力及導(dǎo)管末端芽比例上升[7]。同時(shí)，激素替代療法增加絕經(jīng)期女性的乳腺上皮密度。應(yīng)用孕激素增加了小鼠乳腺基底上皮群的比率且激活了RANKL及Wnt等相關(guān)通路。

衰老為生物體的增齡性功能下降，有基因組失穩(wěn)，端粒耗損，干細(xì)胞衰竭等特征[8]。研究發(fā)現(xiàn)，衰老細(xì)胞積累及其釋放某些細(xì)胞因子和各種蛋白酶，能夠?yàn)槊舾屑?xì)胞群提供癌變環(huán)境。細(xì)胞損傷的增齡性累積是衰老的總原因[9]，同時(shí)，細(xì)胞損傷又為特定細(xì)胞發(fā)生癌變提供有利條件，并最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

目前針對(duì)激素替代療法與乳腺癌的研究主要著力于大范圍的臨床調(diào)研統(tǒng)計(jì)分析及應(yīng)用去勢(shì)的成年雌性小鼠模擬體內(nèi)低激素水平研究激素替代療法與乳腺組織學(xué)及相關(guān)通路，而摘除卵巢構(gòu)建的絕經(jīng)期小鼠模型不能完全模擬絕經(jīng)期衰老及正常的內(nèi)分泌環(huán)境，且切除卵巢會(huì)產(chǎn)生一定的創(chuàng)傷應(yīng)激反應(yīng)。本研究利用無(wú)動(dòng)情周期的老齡小鼠，進(jìn)行激素替代療法，研究雌激素與孕激素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)小鼠乳腺的影響，以期為激素替代療法的臨床用藥及相關(guān)乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)提供相應(yīng)的依據(jù)及指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

C57-WT母本小鼠購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)，本實(shí)驗(yàn)所用小鼠為母本小鼠在SPF級(jí)動(dòng)物房自然繁殖的子代小鼠。

1.1.2 儀器與試劑

流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD；石蠟切片機(jī)，德國(guó)Leica；光學(xué)顯微鏡及解剖顯微鏡，日本尼康。

雌二醇、孕酮粉劑、WM染液、蘇木精及伊紅染液，美國(guó)Sigma；免疫組化抗體ERα及Ki67，美國(guó)Stemcell。

1.2 方法

1.2.1 分組與處理

取16月齡小鼠，隨機(jī)分為3組，每組4只。對(duì)照組以芝麻油灌胃2個(gè)月，短期處理組以雌二醇聯(lián)合孕酮灌胃14 d后改芝麻油灌胃至2個(gè)月，長(zhǎng)期處理組以雌二醇聯(lián)合孕酮灌胃2個(gè)月。根據(jù)臨床用藥指南[10]，雌孕激素聯(lián)合應(yīng)用基本療法為雌二醇0.5～1 mg·d-1結(jié)合孕酮100 mg·d-1，根據(jù)人與動(dòng)物藥物換算公式及結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[11]，本實(shí)驗(yàn)所用雌二醇的劑量為150 μg·kg-1，孕酮?jiǎng)┝繛?5 mg·kg-1。雌二醇和孕酮粉劑按灌胃濃度置于芝麻油中并以超聲助溶。

1.2.2 乳腺WM染色

取小鼠一側(cè)腹股溝處乳腺，置于WM固定液中固定10 h，以70%、50%酒精及超純水梯度處理后，置于WM染色液中過(guò)夜染色，染色后再以70%、95%及100%酒精梯度脫水，最后置于水楊酸甲酯中進(jìn)行透化處理。導(dǎo)管分支點(diǎn)為隨機(jī)選擇一段二級(jí)導(dǎo)管，測(cè)量出長(zhǎng)度(a)及計(jì)數(shù)出其上分支點(diǎn)的數(shù)目(n)，n/a的比值即為單位長(zhǎng)度二級(jí)導(dǎo)管上的分支點(diǎn)數(shù)目。

1.2.3 乳腺HE染色

含有樣本的切片經(jīng)烘片，二甲苯、100%酒精、90%酒精、80%酒精、超純水等處理后以蘇木精染液染色40 s，分化后以伊紅染色2 min，再經(jīng)脫水處理后以中性樹(shù)脂封片。HE染色后對(duì)乳腺導(dǎo)管進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，并對(duì)良性增生的導(dǎo)管比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 乳腺IHC染色

含有樣本的切片經(jīng)烘片，二甲苯、100%酒精、90%酒精、80%酒精、超純水一系列復(fù)水的過(guò)程后以檸檬酸鈉或EDTA進(jìn)行抗原修復(fù)，再經(jīng)氧化氫處理，然后以0.3% PBST進(jìn)行破膜，洗滌后以10%山羊血清進(jìn)行封閉30 min。封閉后的切片去除血清，敷上合適濃度的一抗，4 ℃過(guò)夜后取出，合適濃度的含HRP的二抗孵育1 h后，去除二抗，洗滌后避光加入DAB染液避光孵育5 min，切片泛黃即可，再經(jīng)超純水、濃度梯度的酒精、二甲苯等進(jìn)行脫水，最后以中性樹(shù)脂進(jìn)行封片。IHC染色結(jié)果為導(dǎo)管內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞與總導(dǎo)管細(xì)胞數(shù)目之比，記為染色陽(yáng)性率。陽(yáng)性細(xì)胞為染色為棕色的細(xì)胞。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Graphpad Prism 6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05時(shí)判定為差異顯著。各組間差異顯著性用*表示(P<0.05為*，P<0.01為**，P<0.001為***)。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)小鼠乳腺導(dǎo)管分支的影響

如圖1所示，雌、孕激素長(zhǎng)期聯(lián)合處理后，小鼠乳腺導(dǎo)管密度增加，且乳腺導(dǎo)管三級(jí)分支增加，主要表現(xiàn)為單位長(zhǎng)度乳腺二級(jí)導(dǎo)管上分支點(diǎn)的顯著增多。雌孕激素短期處理后，其導(dǎo)管密度及單位長(zhǎng)度乳腺二級(jí)導(dǎo)管上分支點(diǎn)無(wú)顯著性改變。

2.2 對(duì)小鼠乳腺導(dǎo)管增生的影響

如圖2所示，正常乳腺導(dǎo)管為外層基底上皮、內(nèi)層管腔上皮細(xì)胞的雙層結(jié)構(gòu)。良性增生導(dǎo)管表現(xiàn)為導(dǎo)管內(nèi)細(xì)胞增生呈多層結(jié)構(gòu)，核染色質(zhì)清晰，仍可見(jiàn)管腔。非典型增生表現(xiàn)為導(dǎo)管腔內(nèi)大量不規(guī)則上皮細(xì)胞增生，細(xì)胞增生互相聯(lián)結(jié)，彌漫成片，充塞管腔，形成實(shí)性，且核仁增大，形態(tài)不一，排列紊亂。結(jié)果表明，雌、孕激素長(zhǎng)期聯(lián)合處理后，乳腺導(dǎo)管良性增生比例增加，并出現(xiàn)非典型增生。雌孕激素聯(lián)合短期處理后，乳腺導(dǎo)管組織學(xué)無(wú)顯著改變。

2.3 對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞的影響

如圖3所示，雌、孕激素長(zhǎng)期聯(lián)合應(yīng)用后，小鼠乳腺上皮細(xì)胞中ERα陽(yáng)性細(xì)胞核的比例上升，且增殖相關(guān)標(biāo)志物Ki67的表達(dá)也上升。雌孕激素短期處理后，ERα及Ki67的表達(dá)無(wú)顯著變化。

圖1 WM染色結(jié)果

圖2 HE染色結(jié)果

圖3 IHC染色結(jié)果

3 討論

雌激素、孕激素是乳腺導(dǎo)管發(fā)育及產(chǎn)生功能性作用的重要內(nèi)分泌激素，目前對(duì)這兩者的功能性作用及相互作用機(jī)制尚未闡明。雌孕激素替代療法用于改善圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)期癥狀而在臨床上廣泛應(yīng)用，對(duì)于其增加乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性褒貶不一。目前部分研究表明，雌孕激素長(zhǎng)期聯(lián)合應(yīng)用是乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加的重要因素之一，但也有研究認(rèn)為高估了激素替代療法對(duì)乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加的可能性。同時(shí)，一系列組織學(xué)檢查及動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，雌、孕激素聯(lián)合應(yīng)用使人及小鼠乳腺組織呈高度增殖狀態(tài)，而細(xì)胞過(guò)度分裂及增殖也可能在一定程度上增加如DNA損傷及基因編碼異常的可能性[12-13]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)用老齡小鼠進(jìn)行陰道分泌物涂片染色，其陰道圖片所見(jiàn)細(xì)胞稀疏或無(wú)正常細(xì)胞，不符合正常陰道圖片染色結(jié)果，且實(shí)驗(yàn)處理后解剖發(fā)現(xiàn)，其卵巢均表現(xiàn)為萎縮狀或者形成囊腫，不具備正常卵巢分泌相關(guān)激素功能，因而，本實(shí)驗(yàn)用小鼠符合圍絕經(jīng)期或絕經(jīng)期低雌激素及衰老的內(nèi)環(huán)境。研究結(jié)果表明，經(jīng)雌、孕激素長(zhǎng)期處理后，乳腺導(dǎo)管的密度及分支點(diǎn)增加，表明乳腺處于動(dòng)態(tài)性的增殖狀態(tài)，且乳腺導(dǎo)管良性增生的比例增加，并出現(xiàn)非典型增生結(jié)構(gòu)，而乳腺導(dǎo)管的非典型性增生是乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加的重要表征之一[14-15]，表明雌二醇聯(lián)合孕酮長(zhǎng)期應(yīng)用可增大乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。Ki67作為細(xì)胞增殖的標(biāo)志物被廣泛應(yīng)用，它作為細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原，在正常乳腺細(xì)胞和未病變的乳腺細(xì)胞中也有所表達(dá)，但是陽(yáng)性率低于3%[16]。研究結(jié)果表明，對(duì)照組的Ki67陽(yáng)性率低于3%，表明對(duì)照組小鼠乳腺組織具有正常的增殖狀態(tài)。ERα為雌激素受體成員之一，是雌激素發(fā)揮作用的重要樞紐。已有研究表明，雌激素可作用于ERα，通過(guò)Stat5a及Gata 3等旁分泌機(jī)制作用于臨近細(xì)胞，促進(jìn)周邊細(xì)胞群大量增殖及干細(xì)胞分化等[17]。免疫組化結(jié)果表明，雌、孕激素聯(lián)合處理后ERα的比例上升，Ki67比例上升，結(jié)合WM染色和HE染色結(jié)果，我們推測(cè)這可能是在雌激素與孕激素的聯(lián)合作用下，激活了ERα旁分泌系統(tǒng)，促進(jìn)乳腺導(dǎo)管分支及類腺泡狀導(dǎo)管芽形成，使乳腺組織呈增殖狀態(tài)。

本研究采用了具備天然的無(wú)動(dòng)情周期的老齡小鼠，對(duì)雌激素與孕激素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)小鼠乳腺的影響做了一系列研究。本研究所用的實(shí)驗(yàn)對(duì)象很大程度上模擬了圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)期的低雌激素及衰老內(nèi)環(huán)境的特征，填補(bǔ)了目前研究的不足。雌激素與孕激素聯(lián)合應(yīng)用短期對(duì)乳腺導(dǎo)管各項(xiàng)特征無(wú)顯著影響，不增加乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而長(zhǎng)期應(yīng)用在一定程度上促進(jìn)了乳腺的組織學(xué)改變及上皮細(xì)胞比例構(gòu)成改變，同時(shí)促進(jìn)乳腺組織的增殖。