武雪亮，王立坤，周海豐，郭 飛，楊永江，劉 博，楊東東*，屈 明，薛 軍

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 1.普通外科； 2.超聲醫(yī)學(xué)科； 3.病理科， 河北 張家口 075000)

據(jù)2012年全球腫瘤流行病數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：中國人群的結(jié)直腸癌目前排位死因順位從第7位上升到第5位，男女死亡率分別為9.0/10萬和6.1/10萬，嚴(yán)重威脅國民健康[1]。盡管近年來結(jié)直腸癌的普查力度不斷加強(qiáng)，手術(shù)方式不斷改進(jìn)，靶向藥物大力推廣，并取得了一系列的成就和提高，但結(jié)直腸癌的5年生存率不足60%，仍是公共衛(wèi)生的關(guān)鍵問題，每年造成約608 000例患者死亡[2]。因此，對結(jié)腸直腸癌的深入研究尤對其分子生物學(xué)研究具有很高的臨床價(jià)值。

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(GLUT-1)是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中最重要的成員，廣泛存在于真核生物和原核生物中，在癌癥發(fā)展階段，包括早期腫瘤生長，癌癥轉(zhuǎn)移和侵襲等方面均具有重要作用。相關(guān)報(bào)道證實(shí)，在乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞內(nèi)均發(fā)現(xiàn)GLUT-l的高表達(dá)，GLUT-l的活性和表達(dá)水平與腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[3-5]，而GLUT-1在結(jié)直腸癌方面的研究鮮有報(bào)道。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是細(xì)胞在低氧條件下產(chǎn)生的一種核轉(zhuǎn)錄因子，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，扮演著重要的角色，能增強(qiáng)其侵襲性，是近年研究較多的致癌因子。本研究通過對結(jié)直腸癌和癌旁正常結(jié)直腸組織中GLUT-1和HIF-1α行免疫組織化學(xué)染色分析半定量檢測，旨在探討GLUT-1和HIF-1α在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況及與相關(guān)臨床病理因素間的關(guān)系，為結(jié)直腸癌的靶向診療提供科學(xué)參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

收集河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院普通外科2016年9月至2017年1月手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織50例和同期同例癌旁正常結(jié)直腸組織50例，結(jié)直腸的癌組織自癌灶中心處取得，另外取經(jīng)病理證實(shí)為正常腸組織的標(biāo)本切緣。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，患者知情同意參加本研究。所有病例均為原發(fā)性腫瘤，術(shù)前沒有行針對性治療，如新輔助放化療等，術(shù)后標(biāo)本均在1 h內(nèi)獲得，并存于液氮中。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗GLUT-l多克隆抗體、鼠抗HIF-1α單克隆抗體購于美國Abcam公司；免疫組化試劑盒、DAB顯色劑購于上海Gene Tech公司。光學(xué)顯微鏡：Nikon Eclipse 50；臺式高速離心機(jī)：德國Eppendorf公司；冰凍切片機(jī)：北京格美勝達(dá)醫(yī)療設(shè)備有限公司；低溫冰柜：青島海爾公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色及半定量測定[6]

10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片厚度4 μm，應(yīng)用蘇木精-伊紅染色，行病理診斷。用80℃烤箱對切片進(jìn)行烘烤30 min，再用乙醇進(jìn)行脫水，并使內(nèi)源性過氧化物酶滅活，應(yīng)用枸櫞酸緩沖液行高溫高壓水化修復(fù)過程；之后PBS洗3次，加入一抗(1∶100)50 μL，溫度控制于4℃一夜；再用PBS洗3次，加入二抗50 μL。室溫下DAB顯色，PBS洗3次，蘇木精輕度復(fù)染，鹽酸乙醇分化后流動清水沖洗10 min，梯度乙醇脫水，松節(jié)油透明和樹膠行封片處理，PBS代替一抗作為陰性對照，光鏡下觀察。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量測定，計(jì)算單位面積陽性染色積分光密度值，取均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌、癌旁正常組織中GLUT-1和HIF-1α表達(dá)情況

癌組和癌旁正常組織中GLUT-1表達(dá)量分別為(2.285±0.459)和(1.086±0.148)，組間差異有顯著性(t=8.919，P< 0.001)；癌組和癌旁正常組織中HIF-1α表達(dá)量分別為(2.203±0.401)和(1.055±0.127)，差異有顯著性(t=7.144，P< 0.001)，見圖1、2。

2.2 GLUT-1和HIF-1α表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

GLUT-1和HIF-1α的表達(dá)量都和腫瘤的浸潤深度、分化程度、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移和脈管浸潤有關(guān)(P< 0.05)。TNM分期高、分化程度低、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移和脈管浸潤的患者GLUT-1和HIF-1α的表達(dá)量均升高，而GLUT-1和HIF-1α的表達(dá)量與患者腫瘤大小無相關(guān)性(P> 0.05)，見表1。

注：A1：癌旁正常組織中GLUT-1表達(dá)(×200)；A2：結(jié)直腸癌組織中GLUT-1表達(dá)(×200)；B1：癌旁正常組織中HIF-1α表達(dá)(×200)；B2：結(jié)直腸癌組織中HIF-1α表達(dá)(×400)。圖1 癌旁正常結(jié)直腸組織和癌組織中GLUT-1和HIF-1α蛋白的表達(dá)(SP法)Note. A1: GLUT-1 expression in normal adjacent tissues(×200); A2: GLUT-1 expression in colorectal carcinoma tissues(×200); B1: HIF-1α expression in normal adjacent tissues(×200); B2: HIF-1α expression in colorectal carcinoma tissues(×400).Figure 1 Expression of GLUT-1 and HIF-1α in human colorectal carcinoma tissues and normal adjacent tissues. Streptavidin-peroxidase (SP) method

注：與癌旁正常組織比較，*P< 0.001。圖2 免疫組化半定量表達(dá)檢測分析Note. Compared with the normal adjacent tissues,*P< 0.001.Figure 2 Quantitative immunohistochemical detection and analysis

病理參數(shù)Pathological parametersnGLUT-1表達(dá)量GLUT-1 expression levelHIF-1α表達(dá)量HIF-1α expression level腫瘤大小(cm) Tumor size≥ 5322.289±0.4032.177±0.395< 5182.080±0.4242.039±0.271分化程度 Differentiation degree高 High122.061±0.1071.950±0.101中 Moderate212.330±0.1722.199±0.117低 Low172.510±0.1032.407±0.095漿膜浸潤 Serosal invasion有 Yes392.452±0.3702.343±0.261無 No112.074±0.2512.015±0.239TNM分期 TNM stageⅠ + Ⅱ81.830±0.4021.801±0.399Ⅲ + Ⅳ422.366±0.4572.254±0.346淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 Lymph node metastasis有 Yes332.431±0.3862.320±0.297無 No172.080±0.2721.971±0.254肝轉(zhuǎn)移 Liver metastasis有 Yes72.477±0.4602.366±0.451無 No431.845±0.4111.831±0.402脈管浸潤 Vascular infiltration有 Yes162.358±0.4112.247±0.405無 No341.996±0.2851.961±0.274

注：除腫瘤大小外，其他各病理參數(shù)不同程度間比較，P< 0.05。

Note. Comparison among different degrees for each pathological parameter except for tumor size,P< 0.05.

2.3 GLUT-1和HIF-1α在結(jié)直腸癌中表達(dá)的相互關(guān)系

相關(guān)性分析散點(diǎn)圖表明，GLUT-1和HIF-1α在結(jié)直腸癌中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.958，P< 0.001)，見圖3。

圖3 GLUT-1和HIF-1α相關(guān)性分析散點(diǎn)圖Figure 3 Scatter plot of correlation analysis of GLUT-1 and HIF-1α

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是多個(gè)基因調(diào)控的多步驟、多因素、多階段的復(fù)雜過程，其中失控性生長和不斷侵襲增殖是惡性腫瘤細(xì)胞的最主要特征，這種特征的維系主要靠葡萄糖的無氧酵解為其提供能量，該過程即使在氧充足的環(huán)境下仍可持續(xù)進(jìn)行[7]。由于腫瘤的高消耗、高代謝，需要較普通細(xì)胞成倍的能量。而正常情況下，葡萄糖無法獨(dú)立通過細(xì)胞膜的雙分子層結(jié)構(gòu)，必須依賴跨膜分布的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為載體，因而這類載體的活性及表達(dá)量對腫瘤細(xì)胞的惡性增殖具有極其重要的意義[8]。

GLUT-1是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族最重要的成員，GLUT-l內(nèi)含492個(gè)氨基酸，由12個(gè)疏水性的跨膜α螺旋結(jié)構(gòu)域、兩個(gè)電荷的膜內(nèi)區(qū)及膜外區(qū)構(gòu)成[9]。Deng等[10]解析的人源GLUT-l的晶體結(jié)構(gòu)顯示其經(jīng)典的協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)超家族的折疊方式：12個(gè)跨膜螺旋組成NH2-端和-COOH端2個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中的腔孔呈向胞內(nèi)區(qū)展開，這即是其轉(zhuǎn)運(yùn)的基礎(chǔ)框架。

腫瘤細(xì)胞膜上的GLUT-l的表達(dá)受多種途徑調(diào)節(jié)，目前研究較多的有PI3K/AKT/mTOR(磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白)途徑、HIF-1α(缺氧誘導(dǎo)因子-1α)和p53途徑，PI3K/AKT/mTOR與癌細(xì)胞的增殖、微血管形成和轉(zhuǎn)移蛋白的合成關(guān)系密切，且需要大量能量供應(yīng)，在肝癌、胃癌、子宮癌等腫瘤細(xì)胞中均證實(shí)能上調(diào)GLUT-l的表達(dá)[11]。

本研究顯示GLUT-l和HIF-1α在結(jié)直腸癌中的表達(dá)量明顯高于在癌旁正常組織，表明在腸黏膜癌變的過程中，細(xì)胞膜上的GLUT-l和HIF-1α表達(dá)水平不斷上調(diào)，從而確保腫瘤對能量的攝取。進(jìn)一步研究顯示，GLUT-l和HIF-1α表達(dá)量與結(jié)直腸癌的病理分期、浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移和脈管浸潤均明顯相關(guān)，且散點(diǎn)圖分析顯示二者呈明顯正相關(guān)。HIF-1α是調(diào)控癌細(xì)胞對缺氧耐受的關(guān)鍵蛋白，研究表明：在肝癌細(xì)胞內(nèi)，HIF-1α能直接激活GLUT-l等糖酵解相關(guān)因子活性，從而滿足肝癌細(xì)胞的能量攝取，增強(qiáng)其對缺氧的耐受力[12]；在胃腫瘤體外培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)，缺氧條件下應(yīng)用HIF-1α抑制劑處理后，癌細(xì)胞內(nèi)活性氧比例更高，凋亡更顯著[13]。國內(nèi)楊通印等[14]對142結(jié)直腸癌組織性免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)GLUT-l和HIF-1α表達(dá)明顯高于正常腸黏膜，且二者存在協(xié)同作用，在低氧環(huán)境下，HIF-1α表達(dá)上調(diào)能誘導(dǎo)GLUT-l高表達(dá)，加速癌細(xì)胞糖酵解，促進(jìn)癌細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移。

綜上，GLUT-l異常表達(dá)對結(jié)直腸癌的發(fā)生和進(jìn)展有重要作用，深入探究GLUT-l和HIF-1α的作用機(jī)制有望為結(jié)直腸癌精確治療提供重要的理論依據(jù)。