葛雪筠，周德健，王 斌，陳 蔭

(浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316022)

鮸魚(nibecroaker)，一作米魚，敏子、敏魚，屬于鱸形目石首魚科[1]，中國有著悠久的魚鰾食用歷史，北魏時(shí)期的賈思勰所著《齊民要術(shù)》中就有加工食用石首魚鰾的記載。到了唐朝，魚鰾成為了貢品。在《新唐書·地理志》中記載：吳郡每年貢“壓胞(魚鰾)七斤”。而后到了清朝，魚鰾列為補(bǔ)品。富有膠質(zhì)的魚鰾，與魚翅、燕窩齊名，是“海洋八珍”之一，有“海洋人參”之譽(yù)。魚鰾不僅是筵席名菜，更是有很高的滋補(bǔ)作用和藥用價(jià)值，如滋陰養(yǎng)血、止血補(bǔ)血、補(bǔ)腎益精等[2]?，F(xiàn)代研究表明魚鰾的主要營養(yǎng)成分為高級(jí)膠原蛋白、粘多糖、多種維生素及鈣、鋅、鐵、硒等多種微量元，蛋白質(zhì)含量在80%以上，含有較低的而脂肪，是目前最理想的高蛋白低脂肪的食品[3]。多糖是魚鰾中的有效活性物質(zhì)之一，雖在魚鰾中含量低但具有極高的研究價(jià)值。目前國內(nèi)研究鮸魚魚鰾多為膠原蛋白及其活性[4-5]，而對(duì)于魚鰾多糖研究的甚少，故本實(shí)驗(yàn)研究探索了魚鰾多糖(polysaccharide of swim bladder innibecroaker，PSB)的提取方法、單糖組成等理化性質(zhì)及對(duì)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用，為進(jìn)一步開發(fā)和研究鮸魚魚鰾中的營養(yǎng)成分提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮸魚(購于舟山魚市場(chǎng))；聯(lián)苯雙酯(浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠)；橄欖油；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(SOD)、總一氧化氮合成酶(NOS)測(cè)試盒，均購于南京建成生物科技有限公司；四氯化碳(CCl4)、多聚甲醛、單糖標(biāo)準(zhǔn)品(甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖)(中國藥品生物制品檢定所)，胰蛋白酶(酶活≥50 000，上海源聚生物科技有限公司)、胃蛋白酶(酶活1∶3 000，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 動(dòng)物、儀器與設(shè)備

SPF級(jí)♂ICR小鼠，體重(22±2)g，購于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院。許可證號(hào)：SCXK(浙)2014-0001。恒溫水浴鍋 HH-1 國華電器有限公司；酶標(biāo)儀 iMark；高速離心機(jī) TGL-16M (上海盧湘儀儀器有限公司)；冷凍干燥機(jī)(美國LABCONCO FreeZone)； 1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司);小鼠普通飼料等。

1.3 魚鰾多糖提取方法

將市場(chǎng)購買的大小相仿的鮸魚經(jīng)解剖取出魚鰾，用剪刀剪至數(shù)段后，用2倍體積丙酮浸泡，期間反復(fù)的攪拌進(jìn)行脫脂。將脫脂完全后的魚鰾置于干燥箱中45 ℃烘干。取干燥后的魚鰾30 g經(jīng)粉碎機(jī)粉碎過100目篩后置于燒杯中，并加入30倍體積的蒸餾水。然后首先用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.5后加入4%胃蛋白酶，37 ℃下提取2 h后再用0.1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH至8后加入4%胰蛋白酶[6]，37 ℃下提取2 h，最后用冰醋酸調(diào)回至中性，再升溫至80 ℃提取1 h將酶滅活。將得到的水提物于8 000 r/min高速離心機(jī)離心20 min后留上清液。殘?jiān)瓷鲜鎏崛》椒ㄔ僦貜?fù)提取一次。合并兩次所得上清液，經(jīng)50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積的1/10，加入4倍體積無水乙醇醇沉過夜,然后醇沉物再經(jīng)過Sevege法反復(fù)脫除蛋白，經(jīng)透析袋(截留分子量3 500 Da)流水透析72 h后，冷凍干燥即得1.5 g淡黃色粉末狀魚鰾多糖。

1.4 單糖組成分析

多糖的完全酸水解[7]準(zhǔn)確吸取1.0 mL 2 mol/L 的三氟乙酸(Trifluoroacetic acid, TFA)滴入裝有5.0 mg的多糖樣品的安瓿管中，然后經(jīng)酒精噴燈封管后置于105 ℃烘箱內(nèi)水解反應(yīng) 8 h。水解反應(yīng)完全后將樣品用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移到雞心瓶內(nèi)，用甲醇反復(fù)旋蒸以除去樣品中TFA，最后轉(zhuǎn)移至 離心管中40 ℃烘箱烘干備用。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 干燥至恒重的等摩爾的10種單糖標(biāo)準(zhǔn)品，加入純水充分溶解，配制成1.0 mg/mL的溶液。采用PMP柱前衍生高效液相色譜法[8]對(duì)等摩爾配制的單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液和多糖完全水解后產(chǎn)物進(jìn)行衍生，最后進(jìn)行高效液相色譜分析。

色譜條件 色譜柱：KP-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：PBS(pH=6.7)：乙腈=82∶18(V/V)；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器(254 nm)。

1.5 總糖含量測(cè)定

以甘露糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用硫酸-苯酚法測(cè)定總糖含量[9]。

1.6 硫酸基含量測(cè)定

采用氯化鋇-明膠比濁法測(cè)定[10]。

1.7 分子量測(cè)定

采用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)測(cè)定。色譜條件：色譜柱：Shodex Ohpak SB-804HQ凝膠色譜柱(300 mm×7.8 mm)；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：0.1 mol/L的Na2SO4；流速：0.5 mL/min；檢測(cè)器：示差檢測(cè)器(RID)[11]。以標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖分子量的對(duì)數(shù)(logMw)對(duì)色譜保留時(shí)間(tR)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品分子量。

1.8 動(dòng)物分組給藥

共計(jì)60只雄性小鼠，隨機(jī)分為組，分別標(biāo)記為藥物組(高劑量組、中劑量組、低劑量組)模型組、陽性對(duì)照組和正常組共6組。置于校動(dòng)物房內(nèi)飼養(yǎng)(室溫22～25 ℃，濕度45%～60%)。正常飼養(yǎng)3日后，于每日固定時(shí)間11點(diǎn)進(jìn)行灌胃，其中正常組和模型組分別灌以生理鹽水0.4 mL；高、中、低分別灌以200、100和50 mg/(kg·d)的PSB0.4 mL；陽性對(duì)照組則灌以0.4 mL的聯(lián)苯雙酯溶液。正常給予飼料、水和光照。連續(xù)喂養(yǎng)15 d，在末次給藥1 h后，除正常組灌以純橄欖油外，其余五組小鼠分別灌以0.8% CCl4-橄欖油混合液0.4 mL。造模后禁食不禁水，于12 h后進(jìn)行摘眼球取血，并制備血清。測(cè)定血清中AST、ALT和GSH-PX的活力；取出肝臟，其中每組選取一部分肝臟溶于4%多聚甲醛溶液[12]用來制作肝臟病理組織切片，其余保存于-80℃超低溫冰箱內(nèi)，為制備10%肝臟組織勻漿液[13]用來測(cè)定SOD、MDA和NOS含量做準(zhǔn)備。

1.9 光學(xué)顯微鏡檢查

4%多聚甲醛固定的肝臟組織經(jīng)脫水、石蠟包埋，蘇木-伊紅染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織的形態(tài)變化，并拍照記錄。

1.10 指標(biāo)檢測(cè)方法和數(shù)據(jù)處理

血清中ALT、AST和GSH-PX，肝臟勻漿液的MDA、SOD和NOS得測(cè)定方法，均參照南京建成測(cè)試盒提供的方法。使用SPSS11.5對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析。

肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量(mg)/小鼠體重(g)。

2 結(jié)果與分析

研究表明聯(lián)苯雙酯具有很強(qiáng)的抗氧化作用，能夠抑制肝臟的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，穩(wěn)定肝細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)，保護(hù)肝組織的結(jié)構(gòu)免受如CCl4等各種致病因子的損傷，明顯的抑制肝細(xì)胞中AST和ALT的釋放[14]。故本實(shí)驗(yàn)的陽性對(duì)照組選取了聯(lián)苯雙酯作為參照，用來評(píng)價(jià)PSB對(duì)肝臟的保護(hù)能力。

2.1 單糖組成分析

根據(jù)單糖標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比可知，魚鰾多糖由6種單糖組成，分別為甘露糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖和半乳糖組成，其比為1.4∶1.2∶0.5∶2.0∶0.1∶0.1。通過單糖組成對(duì)比可知，鮸魚魚鰾多糖應(yīng)該也屬于海洋類糖胺聚糖，氨基半乳糖的比例相對(duì)要更高，但是缺乏海洋低等動(dòng)物中常見的巖藻糖。

(1.甘露糖mannose；2.氨基葡萄糖glucosamine；3.鼠李糖rhamnose；4.葡萄糖醛酸glucuronic acid；5.半乳糖醛酸galactolic acid；6.氨基半乳糖galactose；7.葡萄糖glucose；8.半乳糖galactose；9.木糖xylose；10.巖藻糖fucose.)
圖1 單糖標(biāo)準(zhǔn)品的PMP柱前衍生液相色譜圖
Fig.1 HPLC chromatogram of the PMP pre-column derivative standard monosaccharides

圖2 PSB的PMP柱前衍生液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of the PMP pre-column derivative PSB

2.2 總糖含量和硫酸根含量

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可知PSB總糖含量為52.4%，硫酸基含量為14.5%。

2.3 分子量測(cè)定

利用高效凝膠色譜法，測(cè)定純度的同時(shí)根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)品(6.1，9.6，21，47.1，107和194 kD，)的出峰時(shí)間即可推算出多糖的分子量。由PSB的高效凝膠色譜圖3可看出，PSB的出峰且呈現(xiàn)單一對(duì)稱狹窄的峰，表明PSB分子量均一，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-0.331 7x+9.840 4計(jì)算可知PSB的分子量為89.7 kDa。

圖3 PSB的高效凝膠色譜圖Fig.3 HPGCP chromatogram of PSB

2.4 PSB對(duì)CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的作用

2.4.1 PSB對(duì)CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷肝臟指數(shù)的影響 肉眼觀察模型組小鼠肝臟組織與正常肝臟組織對(duì)比肝臟表面出現(xiàn)不同程度的紫色瘀斑和腫大；藥物組中隨著魚鰾多糖質(zhì)量濃度的增加肝臟腫脹程度出現(xiàn)明顯減輕。且綜合表1可以看出，與正常組小鼠肝臟指數(shù)相比，模型組肝臟指數(shù)顯著增大(P<0.01)，說明造模成功。除低劑量組外，藥物組與模型組對(duì)比，肝臟指數(shù)均顯著下降(P<0.05或P<0.01)。陽性藥物組與模型組相對(duì)比肝臟指數(shù)也明顯的降低。由此說明魚鰾多糖能夠有效的抑制小鼠出現(xiàn)肝臟腫大，其效果接近于陽性藥物組。

表1 PSB對(duì)CCl4致小鼠急性肝損傷肝臟指數(shù)的影響(x±s，n=10)Table 1 Effect of PSB on liver index of mice suffering from CCl4-induced acute liver injury

注：*與正常組相比P<0.05，**與正常組相比P<0.01；#、##與模型組相比P<0.05和P<0.01,下同。
Note:*meansP<0.05 compared with the normal group,**meansP<0.01 compared with the normal group;#,## meansP<0.05 andP<0.01 compared with model group,respectively,the same bellow.

2.4.2 PSB對(duì)CCl4誘導(dǎo)致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST和GSH-PX的影響 由表2可知，模型組ALT、AST和GSH-PX的活力與正常組相比顯著升高(P<0.01)。且高劑量組效果與聯(lián)苯雙酯組對(duì)比效果接近；與模型組對(duì)比高劑量與中劑量藥物組顯著降低AST活力(P<0.01)；與模型組對(duì)比高、中、低劑量組的GSH-PX含量顯著升高(P<0.01)，且高劑量與中劑量均接近聯(lián)苯雙酯組，說明隨著魚鰾多糖質(zhì)量濃度的增加保護(hù)肝臟的程度也隨著增強(qiáng)。

2.4.3 PSB對(duì)CCl4誘導(dǎo)致急性肝損傷小鼠肝臟MDA、SOD和NOS的影響 由表3可知，模型組小鼠肝臟MDA含量相比于正常組顯著升高(P<0.01)，而SOD和NOS含量顯著降低(P<0.01)。藥物組肝臟中MDA含量相對(duì)于模型組皆顯著降低(P<0.01)，肝臟中SOD和NOS含量相比于模型組含量顯著升高(P<0.01)。說明PSB對(duì)于肝臟有一定的保護(hù)作用，效果接近陽性藥物組。

表2 PSB對(duì)CCl4誘導(dǎo)致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST和GSH-PX的影響(x±s，n=10)Table 2 Effect of PSB on ALT、AST and GSH-PX of serum from CCl4-induced acute liver injury

Note:①Normal group；②Model group；③Bifendate tables group；④Low dose group；⑤Middle dose group；⑥High dose group

表3 PSB對(duì)CCl4誘導(dǎo)致急性肝損傷小鼠肝臟MDA、SOD和NOS的影響(x±s，n=10)Table 3 Effect of PSB on MDA、SOD and NOS of liver from CCl4-induced acute liver injury

Note:①Normal group；②Model group；③Bifendate tables group；④Low dose group；⑤Middle dose group；⑥High dose group

2.5 PSB對(duì)CCl4誘導(dǎo)致急性肝損傷小鼠肝臟組織的形態(tài)學(xué)變化

由圖4可知，在光學(xué)顯微鏡下A組正常小鼠細(xì)胞中央靜脈周圍肝索排列整齊，如圖箭頭所指：細(xì)胞核大小正常、居中，可見少量雙核細(xì)胞存在，未見細(xì)胞變性、壞死及炎性細(xì)胞浸潤；B組模型組肝小葉模糊中央靜脈附近出現(xiàn)大片的細(xì)胞壞死，且細(xì)胞核消失，發(fā)生氣球樣變性等； C、D和E藥物組肝小葉界限模糊不清，但壞死區(qū)域明顯減少，有炎性細(xì)胞侵潤，且隨著魚鰾多糖PSB質(zhì)量濃度的增加，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系；F組陽性藥物組細(xì)胞未見壞死區(qū)域，且細(xì)胞核大小正常居中,可見雙核細(xì)胞如箭頭所示，細(xì)胞形態(tài)接近于正常組。

2.6 討論

由于肝臟是機(jī)體重要的代謝器官，具有分泌、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能，在糖類、脂類及蛋白質(zhì)三大代謝過程中起著重要作用[15]。一旦肝臟出現(xiàn)損傷，機(jī)體的整個(gè)物質(zhì)代謝將發(fā)生紊亂，繼而能夠影響到其它器官的功能，甚至出現(xiàn)生命危險(xiǎn)。

CCl4作為是一種常用的化學(xué)性肝損傷誘導(dǎo)劑，其誘導(dǎo)所致的小鼠出現(xiàn)的肝損傷表現(xiàn)的癥狀及病理改變特征等與真實(shí)的病毒性肝炎類似[16-18]。當(dāng)肝細(xì)胞受到損害時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)ALT和AST就會(huì)滲入到血液中，使得血清中AST和ALT活性升高[19]。聯(lián)苯雙酯作為我國獨(dú)立開發(fā)的一種肝臟保護(hù)藥物,在臨床上顯示其具有顯著的降低肝臟轉(zhuǎn)氨酶作用,具有良好的保肝效果。綜上可知在肝臟的急性損傷方面，聯(lián)苯雙酯確實(shí)表現(xiàn)出了明顯的保護(hù)作用，在ALT和AST活性方面其效果接近于正常組。而魚鰾多糖組與模型組相比隨著濃度的增加，血中AST和ALT活性顯著降低，說明魚鰾多糖具有一定的保護(hù)肝臟的作用；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)能催化GSH變?yōu)镚SSG是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，同時(shí)促進(jìn)H2O2的分解，并消耗體內(nèi)GSH保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能免受過氧化物的干擾及損害[20-21]，在實(shí)驗(yàn)中可見魚鰾多糖組可以顯著地提高小鼠血液中的GSH-PX的含量，且受魚鰾多糖的濃度影響。

(A．正常組normal group；B.模型組model group；C.低劑量組low dose group；D.中劑量組middle dose group；E.高劑量組high dose group；F.聯(lián)苯雙酯組 bifendate tables group.)
圖4 PSB對(duì)CCl4誘導(dǎo)小鼠肝臟組織形態(tài)改變(HE，x100)
Fig.4 Effect of PSB on hepatic histopathological changes in mice suffering from CCl4-induced acute liver injury(HE，x100)

自由基和脂質(zhì)過氧化是引發(fā)肝損傷重要因素[22-23]，而MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量的變化可反映肝細(xì)胞的損傷程度[24]。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可知模型組相比于正常組MDA的含量顯著地提高，說明肝臟受到了一定的損害，造模成功，而魚鰾多糖組隨著濃度的增加可以顯著地降低肝臟組織中的MDA含量，從而有效的保護(hù)了肝臟免受損害；SOD能夠有效清除生物氧化產(chǎn)生的氧自由基是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，從而防止自由基對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷，其活力的大小可以反映了機(jī)體抗氧化和清除自由基的能力[25]。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知聯(lián)苯雙酯組和魚鰾多糖除低劑量藥物組外能都?jí)蝻@著的升高體內(nèi)SOD的含量，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系；NOS可以參與調(diào)節(jié)NO生成，是一種一氧化氮合成的限速酶，現(xiàn)已認(rèn)識(shí)到NO不僅是一個(gè)有細(xì)胞毒性效應(yīng)器作用的分子，也是組織損傷的誘發(fā)因子和各種病變的增強(qiáng)因子，從而能夠維持正常的生理功能[26-27]，由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，除低濃度PSB組外，其余各組都能顯著提高小鼠體內(nèi)NOS的含量。各指標(biāo)結(jié)合肝臟組織切片，可以看出隨著PSB濃度的增加，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

3 結(jié)語

綜合以上研究結(jié)果，鮸魚魚鰾多糖PSB總糖含量為52.4%，硫酸基含量為14.52%。由甘露糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖和半乳糖組成，分子量為89.7 kDa是一種富含氨基糖和糖醛酸的硫酸化雜多糖。目前海洋魚類魚鰾多糖還沒有研究過，但是海洋動(dòng)物多糖如扇貝多糖，海參多糖等研究較多。海洋動(dòng)物多糖主要含有葡聚糖和雜多糖或類糖胺聚糖[28]，通過單糖組成可知，鮸魚魚鰾多糖應(yīng)該也屬于海洋類糖胺聚糖，氨基半乳糖的比例相對(duì)要更高，但是缺乏海洋低等動(dòng)物中常見的巖藻糖。且PSB中含有一定量的硫酸基團(tuán)表明其為部分硫酸化的多糖，而硫酸化修飾也符合了海洋動(dòng)物多糖的特征[29-30]。

在抗肝損傷的實(shí)驗(yàn)中，不論從小鼠血清和肝臟組織的生化指標(biāo)檢測(cè)，還是從肝臟組織切片病理學(xué)觀察來看，都可以看出鮸魚魚鰾多糖PSB對(duì)CCl4誘導(dǎo)所致的小鼠肝急性損傷具有一定的保護(hù)作用，隨著魚鰾多糖質(zhì)量濃度的增加，肝損傷程度隨之降低，說明魚鰾多糖對(duì)小鼠肝臟的保護(hù)程度與其劑量有一定相關(guān)性。而對(duì)于PSB對(duì)小鼠肝臟的保護(hù)機(jī)理，則需要進(jìn)行更深一步的去研究，同時(shí)本文也為以后進(jìn)一步的研究鮸魚魚鰾多糖提供了一定的理論基礎(chǔ)。