李玉強，王睿甲，李語麗**，孫紅振，李仰平，牟 闖，呂 佳，王 師,2，包振民,3

(1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003；2.海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實驗室，青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室，山東 青島 266237；3.海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室，山東 青島 266237)

棘皮動物在生物進化史上占有獨特的地位，它們是無脊椎動物中進化地位最高的門類，同時也是后口動物中最為古老的種類[1]。仿刺參作為棘皮動物的代表性物種，具有極其重要的研究價值。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，其因營養(yǎng)價值和藥用價值高，已經(jīng)成為了中國、日本、韓國和俄羅斯等地最具價值的水產(chǎn)經(jīng)濟物種之一[2]；在生物學(xué)方面，其夏眠和組織再生的生物學(xué)特性已經(jīng)逐漸成為研究熱點[3]，仿刺參也逐漸成為無脊椎動物中重要的研究物種。鑒于仿刺參在經(jīng)濟上以及生物學(xué)研究上越來越重要的研究價值，在基因組和轉(zhuǎn)錄組水平上對其進行生物學(xué)深度分析，已經(jīng)成為仿刺參研究的重要任務(wù)。近年來，由于RNA-seq技術(shù)的廣泛應(yīng)用，仿刺參在轉(zhuǎn)錄組水平上的研究也有了較大的進展，然而DNA甲基化作為重要的表觀遺傳調(diào)控機制，在仿刺參中的研究仍然比較匱乏，趙業(yè)等曾用同裂酶酶切檢測過仿刺參非夏眠狀態(tài)下組織的DNA甲基化狀況[4]，但是組織中各基因的DNA甲基化的詳細(xì)信息并不完善。

DNA甲基化是DNA分子層面表觀修飾的重要方式。在真核生物中，DNA甲基化參與了多種生物體內(nèi)的生理生化過程，具有重要的生物學(xué)功能，包括維持胚胎的正常發(fā)育[5-6]；使X染色體失活[7]，失活的X染色體上大部分基因的CpG是甲基化的，而在活化的染色體上是非甲基化的[8]；維持染色體穩(wěn)定性：DNA甲基化被證明與轉(zhuǎn)座子活性相關(guān)，在哺乳動物中轉(zhuǎn)座子相關(guān)的DNA序列均呈現(xiàn)出高度甲基化的狀態(tài)，同時保持轉(zhuǎn)錄沉默狀態(tài)[9]。隨著DNA甲基化成為表觀遺傳學(xué)的研究熱點，其相關(guān)生物學(xué)特性也被廣泛研究。隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，全基因DNA甲基化的檢測方法也不斷推陳出新，MethylRAD-Seq技術(shù)結(jié)合了甲基化修飾依賴性內(nèi)切酶和簡化基因組限制性酶切分型技術(shù)的特點，其優(yōu)點在于可以在不知道基因組背景信息的前提下大規(guī)模檢測全基因組范圍內(nèi)的甲基化位點，而且該技術(shù)建庫流程簡單、技術(shù)重復(fù)性好、假陽性率低[6]。

相關(guān)研究表明，無脊椎動物基因組甲基化水平通常低于脊椎動物[10]，而且甲基化標(biāo)記更趨向于出現(xiàn)在基因功能區(qū)而不是基因間區(qū)[11]，也暗示了無脊椎動物甲基化規(guī)律與脊椎動物有所差異?；谏矬w各組織的甲基化狀態(tài)有所差異，本論文選擇了3種仿刺參研究常用且重要的組織(腸道、呼吸樹和性腺常出現(xiàn)于仿刺參研究中，而且其萎縮退化和再生特性是仿刺參夏眠、再生等研究的理想材料)進行后續(xù)研究，通過建立仿刺參3種組織的甲基化文庫，利用本實驗室已經(jīng)拼接完成的部分仿刺參基因組數(shù)據(jù)和表達譜數(shù)據(jù)(未發(fā)表，表達譜數(shù)據(jù)與本研究中的甲基化數(shù)據(jù)來源于同一批但非同一個體的組織材料)初步探究仿刺參組織甲基化狀況及其特異性，為豐富仿刺參甲基化研究內(nèi)容和無脊椎動物的甲基化發(fā)生規(guī)律提供可用信息。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究選用的仿刺參來源于遼寧省大連市獐子島黑石礁海區(qū)(124°47′E, 39°3′N)，組織為成體仿刺參正常狀態(tài)下的腸道、呼吸樹和性腺三種組織。材料取出后立即用PBS沖洗去除材料表面海水以及其他雜質(zhì)，然后用RNAwait浸泡保存于1.5 mL EP管中，帶回實驗室后用吸管將RNAwait吸取干凈，置于-80℃冰箱長期保存，用于后續(xù)DNA提取和甲基化文庫的構(gòu)建。

1.2 Methy RAD-Seq測序文庫的構(gòu)建

首先，采用傳統(tǒng)的酚氯仿抽提法提取仿刺參基因組DNA，其中裂解液更換為CTAB(Tris-HCl 1 mol/L，pH=8.0；EDTA 0.5 mol/L )，DNA 的質(zhì)量用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測；其次，參照Wang等[12]MethylRAD文庫構(gòu)建方法，應(yīng)用MspJ Ⅰ內(nèi)切酶進行組織甲基化文庫構(gòu)建(見圖1)[6]，構(gòu)建過程如下：

圖1 MspJ Ⅰ酶切位點[13]Fig.1 Recognition site of MspJ Ⅰ[13]

(1) MspJ Ⅰ酶切基因組DNA：

MspJ Ⅰ內(nèi)切酶：MspJ Ⅰ是一種識別甲基化位點的核酸內(nèi)切酶，它有特定的識別位點，并在該識別位點兩側(cè)進行酶切，得到一個36 bp的酶切片段。MspJ Ⅰ識別位點見圖1。

首先將事先提取的高質(zhì)量基因組DNA進行濃度稀釋，將濃度控制在100 ng/μL，然后將DNA樣品輕彈混勻，配置如下酶切體系：

DNA sample1 μL(100 ng/μL)MspJI1 μLBSA0.15 μLBuffer41.5 μLEnzyme4.5 μLddH2O7.85 μL

酶切條件：37 ℃酶切4 h。

(2)酶切標(biāo)簽連接接頭：

以第一步酶切產(chǎn)物為底物，每個DNA樣品配置如下反應(yīng)體系：

酶切產(chǎn)物10 μLT4 ligase1 μLT4 buffer2.2 μLMspJ Ⅰ adaptorⅠ 1 μL(5 μmol/L)MspJ Ⅱ adaptor Ⅱ 1 μL(5 μmol/L)ATP2 μL(10 mmol/L)ddH2O4.8 μL

連接條件：4 ℃連接16 h。

(3)一輪PCR富集MSPJ Ⅰ酶切標(biāo)簽：

反應(yīng)體系為:連接產(chǎn)物14 μLdNTP4.8 μL(2.5 μmol/L)phusion0.4 μL5xHF buffer8 μL1stprimer 10.8 μL(10 μmol/L)1stprimer 20.8 μL(10 μmol/L)ddH2O11.2 μL

反應(yīng)條件：98 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，進行14～18個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

(4)二輪PCR引入Barcode序列：

模板6 μLdNTP4.8 μL(2.5 μmol/L)2nd Primer0.4 μL(10 μmol/L)Barcode0.4 μL(2 μmol/L)5xHFbuffer8 μLPhusion0.4 μLddH2O20 μL

反應(yīng)條件：98 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，進行5～7個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

(5)PCR產(chǎn)物純化回收

使用QIAGEN PCRPurification Kit回收純化PCR產(chǎn)物。

最后用Qubit測定純化后樣品濃度，按照每個文庫DNA總量相等的原則，將文庫等量混樣，使用Illumina Hiseq2000平臺進行Single end 50 bp測序。

試劑：

MspJ Ⅰ(New EngLandBioLabs，產(chǎn)品型號R0661L)

T4 DNA Ligase(New EngLandBioLabs，產(chǎn)品型號M0202L)

Phusion(New EngLandBioLabs，產(chǎn)品型號M0535L)

QIAGEN PCR Purification Kit(Qiagen，產(chǎn)品型號28106.0)

Qubit 2.0 fluorometer(Invitrogen，產(chǎn)品型號Q32866)

1.3 測序數(shù)據(jù)處理及分析

1.3.1 測序數(shù)據(jù)處理 由于仿刺參基因組未完全拼接完成，大部分scaffold長度較短，所以本研究從已拼接的基因組中篩選出最長的1 000條scaffold作為參照基因組進行后續(xù)分析。

數(shù)據(jù)質(zhì)量控制：測序數(shù)據(jù)為單端50 bp的reads，為保證數(shù)據(jù)質(zhì)量，首先對測序得到的fastq格式的文件處理，進行數(shù)據(jù)質(zhì)量過濾。質(zhì)量過濾的條件為：(1)首先截取reads的前30 bp作為有效序列；(2)過濾掉含有總長度10%數(shù)量的N(不確定的堿基)的測序reads；(3)過濾掉含有總長度20%數(shù)量的低質(zhì)量(質(zhì)量值低于10)堿基的reads；(4)過濾掉含有超過10個連續(xù)堿基的reads；(5)統(tǒng)計測序得到的總的reads量、每個文庫的數(shù)據(jù)量，以及經(jīng)過質(zhì)量控制后的數(shù)據(jù)量，以檢測文庫的質(zhì)量。

甲基化標(biāo)簽在仿刺參基因組上的分布：首先從仿刺參參照基因組中提取含有CG二核苷酸、長度為30 bp和含有CHG三核苷酸、長度為29 bp的序列，使用soap軟件[14-15]，將高質(zhì)量標(biāo)簽與基因組提取的標(biāo)簽進行唯一比對，統(tǒng)計每個位點的甲基化標(biāo)簽深度，以reads深度代表位點的甲基化水平。分別統(tǒng)計各個樣本在不同位點處的甲基化水平，若樣本的某個標(biāo)簽在檢測深度大于5，則認(rèn)為此樣本的該位點發(fā)生了甲基化。

計算甲基化頻率可以反映基因組的總體甲基化水平，甲基化頻率是指平均出現(xiàn)一個甲基化位點的堿基數(shù)目，即相應(yīng)區(qū)域長度/該區(qū)域內(nèi)甲基化標(biāo)簽數(shù)目，計算公式為相應(yīng)區(qū)域總長度÷該區(qū)域內(nèi)甲基化標(biāo)簽數(shù)量。

1.3.2 不同組織基因甲基化水平差異性分析 參照RPKM計算方式，將基因甲基化水平計算公式定義為：total methylated tags/(mapped reads(millions)×gene lenth(kb))。計算并統(tǒng)計出各組織中基因的甲基化水平。

在各組織基因甲基化水平已知的基礎(chǔ)上，利用R軟件包中的“edgeR”函數(shù)分別進行兩種組織之間基因甲基化水平的差異分析，然后將3組差異分析中的差異基因(p<0.05為篩選閾值)匯總進行Gene Ontology(GO)功能富集分析，從而更好地了解各組織之間甲基化水平差異基因所涉及的相關(guān)生物學(xué)過程。

1.3.3 基因甲基化水平與表達水平之間的相關(guān)性分析 基因甲基化位點發(fā)生位置不同，對基因表達調(diào)控的作用也有所區(qū)別[16]。在脊椎動物中，通常啟動子區(qū)域發(fā)生甲基化伴隨著基因轉(zhuǎn)錄沉默或轉(zhuǎn)錄抑制[16-17]，與此相比，無脊椎動物中DNA甲基化規(guī)律與調(diào)控機制不同。為了更好的了解仿刺參組織中甲基化位點在啟動子與基因功能區(qū)對基因表達調(diào)控之間的相關(guān)性，本研究通過整合已有的甲基化文庫數(shù)據(jù)與仿刺參表達譜數(shù)據(jù)，對各部分基因進行了分析。首先，在獲得參照基因組基因相關(guān)的甲基化標(biāo)簽位置信息的基礎(chǔ)上，將基因分為以下3部分：只在啟動子區(qū)域有甲基化標(biāo)簽分布的基因、只在基因功能區(qū)有甲基化標(biāo)簽分布的基因以及在啟動子區(qū)域和基因功能區(qū)均有甲基化標(biāo)簽分布的基因；其次，分別繪制各組織所有基因以及各部分基因甲基化水平與表達量之間的相關(guān)性散點圖，進而使用R軟件包中的“cor.test”函數(shù)進行相關(guān)性檢驗(method=“pearson”)分析基因甲基化水平與表達水平之間的相關(guān)性。

2 實驗結(jié)果

2.1 仿刺參組織的MethylRAD文庫數(shù)據(jù)統(tǒng)計及甲基化位點鑒定

對已經(jīng)拼接完成的仿刺參最長的前1 000條scaffold中的MspJ Ⅰ酶酶切位點通過計算機進行電子酶切分析，數(shù)據(jù)顯示總共有4 234 227個酶切位點，CG和CHG型各占1 699 838和2 534 389個，當(dāng)酶切位點中H=C時，甲基化標(biāo)簽為CCG型，為方便統(tǒng)計分析，本研究后續(xù)分析將此類標(biāo)簽歸為CG型。測序結(jié)果顯示，3個樣本總共獲得77 505 862條reads，其中高質(zhì)量reads有77 432 392條，占總reads的99.9%以上，前1 000條scaffold上總唯一比對reads數(shù)為6 598 460條，具體信息見表1。對3種組織樣本的酶切標(biāo)簽進行甲基化位點進行鑒定分析，其中CG型甲基化位點比例明顯高于CHG型甲基化位點，且不同組織中各甲基化位點類型所占比例表現(xiàn)出高度一致性。腸道、呼吸樹和性腺3種組織檢測到的甲基化位點數(shù)分別為114 417、128 251和136 423，其中檢測深度大于5的位點數(shù)分別為45 202、52 288和56 786，各組織的甲基化位點類型見表2。圖2所示的是3種組織中甲基化位點分型比例，從圖中可以清晰的看出CG型甲基化位點占甲基化位點的主要部分，約91%(其中CCG類型約為8.6%)，而CHG型只占9%左右，2種類型的標(biāo)簽比例與電子酶切結(jié)果相反。

表1 MethylRAD文庫測序原始數(shù)據(jù)Table 1 The primary data of MethylRAD libraries

Note: Int.：腸道；Res.:呼吸樹；Gon.：性腺。Int Res and Gon represent intestine,respiratory trees and gonad respectively.

表2 甲基化位點數(shù)目及類型統(tǒng)計Table 2 Number and type statistics of methylation sites

Note: Int.：腸道；Res.:呼吸樹；Gon.：性腺。Int Res and Gon represent intestime,respiratory trees and gonad respectively.

圖2 CG和CHG型甲基化位點比例Fig.2 Percentage of methylation sites of CG and CHG

2.2 仿刺參組織中甲基化位點的分布特征分析

利用仿刺參參照基因組，將MethylRAD文庫測序中檢測到的MspJ Ⅰ甲基化標(biāo)簽定位到基因區(qū)及非基因區(qū)。甲基化標(biāo)簽在基因的啟動子區(qū)(promoter)(轉(zhuǎn)錄起始位點上游2k的范圍)，UTR區(qū)，CDS區(qū)，內(nèi)含子區(qū)(intron)以及在非基因區(qū)的基因間區(qū)(intergenic)均有分布。甲基化標(biāo)簽分布結(jié)果(見表3)顯示：腸道、呼吸樹和性腺3種組織的甲基化標(biāo)簽均有較大比例分布于基因間區(qū)，位點數(shù)目分別為20 176(44.64%)、23 409(44.77%)和26 076(45.92%)；CDS區(qū)域略低于內(nèi)含子區(qū)，位點數(shù)目為10 135(22.42%)、11 515(22.02%)和11 573(20.38%)，內(nèi)含子區(qū)域位點數(shù)目分別為12 494(27.64%)、14 646(28.01%)和16 059(28.28%)；啟動子區(qū)域位點數(shù)目分別為2 022(4.47%)、2 298(4.39)和2 572(4.53%)；占比最小的區(qū)域為UTR區(qū)，為375(0.83%)、420(0.80%)和506(0.89%)。對2種不同類型的甲基化標(biāo)簽分別進行統(tǒng)計。從表3中可以看出3種組織的2種甲基化位點分布狀況具有很高的一致性，不同類型的甲基化位點在不同區(qū)域的分布比例略有差別。CG型甲基化位點在基因間區(qū)的分布比例明顯高于其它區(qū)域，CDS區(qū)域所占比例低于內(nèi)含子區(qū)域；而CHG型甲基化位點在基因間區(qū)的分布比例相對較低，在基因功能區(qū)與CG型位點分布不同，CHG型在CDS區(qū)的占比要高于內(nèi)含子區(qū)域。

表3 甲基化標(biāo)簽在不同區(qū)域的分布Table 3 Distribution of methylation tags in different region

為了深入了解仿刺參甲基化位點的分布特征，我們通過統(tǒng)計基因間區(qū)和基因功能區(qū)各區(qū)域的長度，分別計算得到各組織甲基化標(biāo)簽在不同區(qū)域的標(biāo)簽頻率。統(tǒng)計結(jié)果(見表4)顯示3種組織在各區(qū)域的標(biāo)簽密度趨勢一致性較高。CDS區(qū)域標(biāo)簽密度明顯大于其它區(qū)域，分別為1 447堿基、1 273堿基和1267堿基；標(biāo)簽密度最小的區(qū)域為基因間區(qū)和5’UTR區(qū)域，分別是11 748堿基、10 144堿基、9 103堿基和7 722堿基、6 499堿基、5 416堿基，低于已報道的其他無脊椎動物[18]。

表4 甲基化標(biāo)簽在不同區(qū)域的頻率Table 4 Frequency of methylation tags in different region

2.3 不同組織甲基化基因的差異分析

3種組織之間在甲基化位點及分布特征上存在較高的一致性，但是各組織也存在其本身的特異性。3種組織甲基化基因韋恩圖(見圖3)顯示：各組織均有其本身的特異甲基化基因，其中呼吸樹組織特異甲基化基因最多，有387個，腸道組織特異甲基化最少，有55個，性腺組織有216個。利用R軟件包中“edgeR”函數(shù)對3個組織的甲基化基因進行差異分析，篩選(p<0.05為閾值)出各組織之間的差異基因(見圖4)，結(jié)果顯示呼吸樹組織和性腺組織之間甲基化水平差異基因最多，為1 483個，腸道組織與性腺組織之間甲基化水平差異基因最少，有669個。對3種組織甲基化水平差異基因進行功能富集分析，分析結(jié)果(見表5)顯示組織間甲基化水平差異基因涉及到多種重要的生物學(xué)過程，包括生物體繁殖、脅迫應(yīng)對機制、大分子合成及物質(zhì)代謝、能量代謝等重要生命活動相關(guān)生物過程。

圖3 三種組織甲基化基因分析Fig.3 Analysis of methylated gene in three tissues

圖4 三種組織甲基化基因差異分析結(jié)果Fig.4 Analysis of differentially methylated genes in three tissues

表5 三種組織甲基化水平差異基因GO富集分析Table 5 GO enrichment of differently methylated genes in three tissues

2.4 仿刺參組織基因甲基化水平與表達水平之間的相關(guān)性分析

圖5～7所示是3種組織中有甲基化修飾基因的甲基化水平與表達水平的相關(guān)性。脊椎動物甲基化位點主要分布基因間區(qū)，啟動子區(qū)域發(fā)生DNA甲基化對基因表達主要起抑制作用[18]。為了驗證仿刺參組織中DNA甲基化是否符合這一規(guī)律，我們分別調(diào)查了仿刺參3個組織3類甲基化基因(如1.3所述分類)及全部甲基化基因的甲基化水平與基因表達水平的相關(guān)性。從圖中可以看出，與脊椎動物不同，仿刺參3種組織所有甲基化基因的甲基化水平與表達水平均呈現(xiàn)出弱的正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)均為0.30左右。為了進一步驗證這種正相關(guān)性，我們繪制了3種組織甲基化基因與非甲基化基因的基因表達水平分布圖(見圖8)，結(jié)果顯示各組織甲基化基因(黃色箱體所示)表達水平明顯高于非甲基化基因(藍色箱體所示)。

(A.所有甲基化基因甲基化水平與表達水平相關(guān)性；B.在啟動子和基因功能區(qū)均有甲基化標(biāo)簽分布的基因甲基化水平與表達水平相關(guān)性；C.只在啟動子區(qū)域有甲基化標(biāo)簽分布的基因甲基化水平與表達水平相關(guān)性；D.只在基因功能區(qū)有甲基化標(biāo)簽分布的基因甲基化水平與表達水平相關(guān)性；LM代表基因的甲基化水平；RPKM代表基因的表達水平；r代表相關(guān)系數(shù)。A.The association between level of methylation and expression level about all the methylated genes; B.The association between level of methylation and expression level about the gene that methylation tags located in promoter and gene body region; C.The association between level of methylation and expression level about the gene that methylation tags only located in promoter region; D.The association between level of methylation and expression level about the gene that methylation tags only located in gene body respectively in the tissue of intestine; LM represent genes’ level of methylation; RPKM represent the expression level of gene;rrepresent correlation coefficient.)
圖5 腸道組織各部分基因甲基化水平與表達量相關(guān)性
Fig.5 The association between genes’ level of methylation and expression level in intestine

(A.所有甲基化基因甲基化水平與表達水平相關(guān)性；B.在啟動子和基因功能區(qū)均有甲基化標(biāo)簽分布的基因甲基化水平與表達水平相關(guān)性；C.只在啟動子區(qū)域有甲基化標(biāo)簽分布的基因甲基化水平與表達水平相關(guān)性；D.只在基因功能區(qū)有甲基化標(biāo)簽分布的基因甲基化水平與表達水平相關(guān)性；LM代表基因的甲基化水平；RPKM代表基因的表達水平；r代表相關(guān)系數(shù)。A.The association between level of methylation and expression level about all the methylated genes; B.The association between level of methylation and expression level about the gene that methylation tags located in promoter and gene body region; C.The association between level of methylation and expression level about the gene that methylation tags only located in promoter region; D.The association between level of methylation and expression level about the gene that methylation tags only located in gene body respectively in the tissue of intestine; LM represent genes’ level of methylation; RPKM represent the expression level of gene;rrepresent correlation coefficient.)
圖6 呼吸樹組織各部分基因甲基化水平與表達水平相關(guān)性
Fig.6 The association between genes’ level of methylation and expression level in respiratory tree

(A.所有甲基化基因甲基化水平與表達水平相關(guān)性；B.在啟動子和基因功能區(qū)均有甲基化標(biāo)簽分布的基因甲基化水平與表達水平相關(guān)性；C.只在啟動子區(qū)域有甲基化標(biāo)簽分布的基因甲基化水平與表達水平相關(guān)性；D.只在基因功能區(qū)有甲基化標(biāo)簽分布的基因甲基化水平與表達水平相關(guān)性；LM代表基因的甲基化水平；RPKM代表基因的表達水平；r代表相關(guān)系數(shù)。A.The association between level of methylation and expression level about all the methylated genes; B.The association between level of methylation and expression level about the gene that methylation tags located in promoter and gene body region; C.The association between level of methylation and expression level about the gene that methylation tags only located in promoter region; D.The association between level of methylation and expression level about the gene that methylation tags only located in gene body respectively in the tissue of intestine; LM represent genes’ level of methylation; RPKM represent the expression level of gene;rrepresent correlation coefficient.)
圖7 性腺組織各部分基因甲基化水平與表達量相關(guān)性
Fig.7 The association between genes’ level of methylation and expression level in gonad

(M：甲基化基因，UM：非甲基化基因。 M and UM represent methylated and unmethylated genes in tissues.)
圖8 甲基化基因和非甲基化基因的表達水平
Fig.8 Expression level of methylated and unmethylated genes

3 討論

通過對仿刺參甲基化位點鑒定及分布特征的分析顯示：仿刺參3種組織的甲基化位點主要分布于基因功能區(qū)，與之前文獻報道的其他無脊椎動物如海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)[19]、玻璃海鞘(Cionaintestinalis)[20]、牡蠣(Crassostreagigas)[21]等基因組甲基化位點分布狀況類似。甲基化位點類型分析顯示CG型甲基化位點明顯多于CHG型甲基化位點，而在電子酶切產(chǎn)生的數(shù)據(jù)中CHG型位點多于CG型，可能的原因在于實際情況中符合酶切位點的堿基組成可能未發(fā)生甲基化，同時表明CG型堿基組成更容易發(fā)生甲基化。對基因功能區(qū)甲基化位點特征分析顯示，甲基化位點密度要遠(yuǎn)小于已報道的無脊椎動物[18]，主要的原因可能是：(1)為防止假陽性位點而提高篩查標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致遺漏部分真實甲基化位點；(2)參照基因組并未拼接完全，影響標(biāo)簽比對結(jié)果。

仿刺參組織DNA甲基化總體分布特征(標(biāo)簽在功能區(qū)的分布比例)差別較小，而甲基化水平與基因表達水平呈弱的正相關(guān)性。對各組織之間DNA甲基化圖譜的比較分析發(fā)現(xiàn)仿刺參各組織之間甲基化差異程度較小，甲基化位點分布以及類型一致性較高。不同組織中甲基化位點的總體分布規(guī)律及基因甲基化水平與表達水平相關(guān)性呈現(xiàn)出較高的一致性，這可能跟特定物種的甲基化分布規(guī)律有關(guān)。同時，各組織的甲基化也存在各自的特異性。首先各組織均有其特有的一部分甲基化基因，其次各組織之間相同基因的甲基化水平有所差異，仿刺參3種組織甲基化差異的基因涉及多種生物學(xué)過程，主要包括繁殖、壓力應(yīng)激、大分子合成等，對應(yīng)于不同組織的不同功能。

對3種組織甲基化基因的甲基化水平與表達水平的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，甲基化標(biāo)簽的分布區(qū)域基本不影響基因甲基化水平與基因表達量之間的相關(guān)性，而且各部分基因甲基化水平與表達量均呈現(xiàn)出弱的正相關(guān)趨勢；而圖8則顯示各組織中發(fā)生甲基化的基因表達水平普遍高于未發(fā)生甲基化的基因，且3種組織結(jié)果一致。以上結(jié)果暗示了仿刺參基因組中DNA甲基化可能起到促進基因表達的作用，之前牡蠣的研究結(jié)果也呈現(xiàn)出了類似的規(guī)律[22]。這種促進表達的可能的機制一是不同于脊椎動物甲基化主要分布在promoter區(qū)，而已研究的無脊椎動物(如仿刺參、牡蠣等)的甲基化主要發(fā)生在基因區(qū)，暗示了它們甲基化的功能可能存在一定的差異，二是甲基化會抑制某些轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄從而促進其宿主基因的表達[23]，另外，某些組蛋白修飾(如H3K36me3)能夠召集甲基化酶[24]，從而促進基因的表達。但是考慮到DNA甲基化與基因表達相互關(guān)系的復(fù)雜性及相關(guān)證據(jù)目前還較少，因此對于無脊椎動物中DNA甲基化與基因表達相互關(guān)系的規(guī)律探究還需要更深入的研究和更多的證據(jù)。

本文通過分析仿刺參3種組織的DNA甲基化文庫數(shù)據(jù)，得到了組織的甲基化位點類型、分布以及概況等詳細(xì)信息，分析了其甲基化特性，并通過整合甲基化文庫數(shù)據(jù)與已有的表達譜數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)仿刺參基因組DNA甲基化與基因表達之間呈弱的正相關(guān)性，為無脊椎動物基因組甲基化研究提供可用信息。