張震，張俊，王現(xiàn)軍，閆躍飛，趙玉璽，閆磊

（1.河南省奶牛生產(chǎn)性能測定中心，河南鄭州450046；2.河南省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)部免疫學重點實驗室，河南鄭州450002；3.河南省奶牛健康養(yǎng)殖國際聯(lián)合實驗室，河南鄭州450046；4.河南省鼎元種牛育種有限公司，河南鄭州450008；5.河南省種牛遺傳性能測定中心，河南鄭州450046；6.河南乾祥農(nóng)牧科技有限公司，河南鄭州450002）

隨著人民生活質(zhì)量的提高，對牛奶的需求呈現(xiàn)逐年上升趨勢。牛奶被稱作大自然賦予人類最接近完美的食品，不僅富含蛋白、脂肪等常規(guī)營養(yǎng)物質(zhì)，而且還含有很多其他食品中沒有或少有的活性物質(zhì)，因此，牛奶越來越被大眾接受和喜愛，現(xiàn)已成為大家生活中必需品。目前我國對牛奶的安全管理和相關研究大多集中在微生物[1]、農(nóng)藥[2]、抗生素[3]和重金屬[4]等指標，對于牛奶中激素殘留的安全性研究較少，而且尚無官方的管理標準[5]。近年來，不少專家學者開始研究食物中激素對大眾健康的影響，尤其是牛奶[6]。牛奶中含有相當量的激素，如孕酮，人類長期食用含有該激素水平的牛奶，是否對人體健康有較大影響，越來越受到學術界關注。

牧場生鮮乳的質(zhì)量安全直接決定乳制品的質(zhì)量安全，因此，從源頭上研究和把控生鮮乳中激素殘留，對于研究和控制乳制品中激素含量具有重要意義。依據(jù)目前行業(yè)檢測標準NY/T 2069-2011《牛乳中孕酮含量的測定高效液相色譜-質(zhì)譜法》[7]以及在此標準上所做方法優(yōu)化，本研究對河南省44家牧場生鮮乳進行孕激素孕酮含量的檢測，旨在初步統(tǒng)計河南省牧場生鮮乳中孕酮殘留水平的現(xiàn)狀，為生鮮乳中孕酮含量深入研究提供基礎數(shù)據(jù)，也為相關單位制定標準提供一些數(shù)據(jù)參考。

1 材料

1.1 生鮮乳樣品

1.1.1 樣品來源

從2017年8月到2017年12月，采集覆蓋全省13個地級市的牧場生鮮乳大罐混合樣。

1.1.2 樣品采集

按照《乳與乳制品采樣指南》[8]，總共采集全省44家牧場生鮮乳大罐混合樣，均取采樣當天或前一天的全天混合奶樣，采集后4℃冷鏈保存，24 h內(nèi)送達實驗室。

1.2 試劑

孕酮標準品（1 000 μg/mL，純度≥98.0%）：北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；乙腈（HPLC級，純度≥99.9%）、乙酸銨（HPLC級，純度≥99.0%）：MACKLIN公司；甲醇（LC-MS級，純度≥99.9%）、甲酸（HPLC級，純度≥98.0%）：ALADDIN公司；乙酸鉛（分析純）：天津市科密歐有限公司；純化水：Watsons公司。

1.3 儀器

高效液相色譜儀（LC 1290）、三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀（MS/MS 6460）、固相萃取裝置、色譜柱Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）：美國Agilent公司；高速離心機：SIGNA公司；超聲波儀：北京中晟銘科技有限公司；高速振蕩混合器（QB-600）：海門市其林貝爾儀器公司；C18 固相萃取柱（500 mg，6 mL）：Agela公司；0.45 μm微孔有機濾膜：天津市津騰實驗設備有限公司。

2 方法

2.1 液質(zhì)參數(shù)

2.1.1 液相參數(shù)設置

色譜柱：Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相：A（5 mmol/L乙酸銨溶液+0.1%甲酸）和B（乙腈）；進樣體積：10 μL；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；梯度洗脫。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

2.1.2 質(zhì)譜參數(shù)設置

（1）電離方式：電噴霧電離，正離子；（2）離子噴霧電壓：3.5 kV；（3）霧化氣：氮氣，40 psi（1 psi=6.895 kPa）；（4）干燥氣：氮氣，流速 10 L/min，溫度 350℃；（5）碰撞氣：高純氮氣；（6）分辨率：Q1（單位）Q3（單位）；（7）掃描模式：多重反應監(jiān)測，具體參數(shù)見表2。采用“三離子”原則定性定量檢測，定性時相對離子豐度的最大允許偏差見表3。

表2 孕酮多重反應監(jiān)測參數(shù)Table 2 Multiple reaction monitoring parameters of progesterone

表3 定性時相對離子豐度的最大允許偏差Table 3 The maximum allowable deviation of relative ion abundance when qualitative

2.2 濃度梯度標準溶液的配制

準確吸取適量孕酮標準品溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，配制成濃度為100 ng/mL的標準儲備液，再用基質(zhì)溶液依次稀釋成濃度梯度0.1、0.5、1、2、5 ng/mL 的標準工作溶液。

2.3 樣品處理

2.3.1 提取

1）稱取5 g（精確至0.001 g）奶樣于50 mL離心管中，分別加入15 mL甲醇和1 mL 20%乙酸鉛溶液，渦旋振蕩30 s，超聲提取10 min，10 000 r/min高速離心10 min。

2）取上清液，置于25 mL容量瓶中，向離心管殘渣中加入5 mL甲醇，重復操作（1）提取步驟，即振蕩30 s，超聲10 min，1 000 r/min離心10 min，合并上清液，用甲醇定容，得到25 mL甲醇提取液。

2.3.2 凈化

1）把C18固相萃取小柱置于固相萃取裝置，進行活化處理，依次加入5 mL甲醇和5 mL水。

2）吸取5 mL甲醇提取液，再用5 mL水稀釋，可得10 mL混合液，把10 mL混合液上C18固相萃取柱，再用5 mL水淋洗固相萃取柱，抽干后用2 mL乙腈洗脫。

3）洗脫液過0.45 μm有機濾膜，供液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜分析。

3 結果與分析

3.1 孕酮標準曲線的繪制

孕酮標準曲線圖見圖1。

圖1 孕酮標準曲線圖Fig.1 Calibration curve of progesterone

本檢測采用校正標準曲線，外標法定量。從圖1可知，在0.1 ng/mL～5 ng/mL濃度范圍內(nèi)，線性方程為Y=2 448.1X-13.6，相關系數(shù)為0.999 9，表明孕酮在濃度0.1 ng/mL～5 ng/mL范圍內(nèi)有較好線性關系，檢測數(shù)據(jù)可信度高，可用于實際樣品的檢測分析。

3.2 孕酮加標回收率和精密度的測定

通過孕酮的加標回收試驗，來驗證所建檢測方法的可靠性。添加回收率和精密度見表4。

表4 純奶中孕酮添加回收率和精密度（n=6）Table 4 The recoveries and RSD of progesterone in pure milk（n=6）

由表4可知，每組孕酮添加水平重復檢測6次，在添加濃度0.1 ng/mL～1 ng/mL范圍內(nèi)，生鮮乳中孕酮檢測的回收率為80%～105%，相對標準偏差RSD≤8.9%，滿足生鮮乳中孕酮檢測的要求。

3.3 牧場生鮮乳中孕酮含量的測定

從2017年8月到12月份，基本每月1～2次到不同地區(qū)牧場采集生鮮乳樣品，總共采集44家牧場生鮮乳，對其孕酮含量進行測定，并對獲得數(shù)據(jù)進行分析。

3.3.1 44家牧場生鮮乳樣品孕酮檢測結果

牧場生鮮乳中孕酮含量最小值、最大值和平均值見表5。

表5 牧場生鮮乳中孕酮含量最小值、最大值和平均值Table 5 The minimum，maximum and average content of progesterone in pasture fresh milk

由表5檢測統(tǒng)計數(shù)據(jù)可知，44家牧場生鮮乳中孕酮含量大致在 3.3 μg/kg～16.9 μg/kg，平均值為 7.4 μg/kg。

3.3.2 44家牧場生鮮乳孕酮含量趨勢分布狀況

牧場生鮮乳中孕酮含量趨勢分布結果見表6。

表6 牧場生鮮乳中孕酮含量趨勢分布結果Table 6 Distribution tendency of pastures of progesterone in fresh milk

從表6可知，大多數(shù)牧場生鮮乳孕酮含量集中在4 μg/kg～10 μg/kg，其中，孕酮含量在 4 μg/kg～8 μg/kg的牧場最多。

3.3.3 不同月份牧場生鮮乳中孕酮平均含量的比較

對被檢測44家牧場生鮮乳中孕酮殘留，8月、9月、10月、11月和12月份被檢測牧場平均值進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，比較平均值隨月份變化的趨勢，結果見圖2。

圖2 全省生鮮乳中8～12月孕酮含量平均值的比較Fig.2 The comparison of average progesterone content of fresh milk from August to December in whole province

從圖2中數(shù)據(jù)可看出，從2017年8月到12月，每月被檢測牧場生鮮乳孕酮含量平均值呈逐漸下降的趨勢，分析原因，這可能與隨著溫度的降低，各牧場懷孕牛逐步增多及產(chǎn)犢高峰期的到來有關。

4 結論與討論

從試驗數(shù)據(jù)可知，所建立用高效液質(zhì)色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法檢測生鮮乳中孕酮方法，繪制孕酮標準曲線的相關系數(shù)是0.999 9，相關性較好，可以用于實際生鮮乳樣品的檢測分析。孕酮的加標回收試驗顯示，加標回收率在80%～105%之間，說明所建方法符合回收率要求，所建立的檢測方法是可靠的，可用該方法進行大批量生鮮乳樣品孕酮含量的檢測。檢測44家牧場生鮮乳中孕酮殘留統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，河南省牧場生鮮乳中孕酮含量在 3.3 μg/kg～16.9 μg/kg 之間，平均值 7.4 μg/kg，大多數(shù)牧場生鮮乳孕酮含量集中在4 μg/kg～10 μg/kg，且孕酮含量隨天氣溫度降低呈下降趨勢。

現(xiàn)代奶牛生產(chǎn)中，孕激素和雌激素一起被用于誘導奶牛發(fā)情和泌乳，因此，牧場生鮮乳中孕激素殘留包括奶牛本身產(chǎn)生的孕激素（即內(nèi)源性孕激素）和用于奶牛生產(chǎn)的孕激素（即外源性孕激素）。分析牧場生鮮乳中會有孕酮殘留的原因，可能有以下3點：第一，與100年前相比[9]，現(xiàn)代奶牛品種不同[10]，現(xiàn)代飼養(yǎng)奶牛多為高產(chǎn)奶牛，如荷斯坦奶牛，多數(shù)經(jīng)基因改良，而不同品種的奶牛生鮮乳中激素含量不同；第二，現(xiàn)代奶牛飼養(yǎng)方法不同[11]，牧場為提高奶牛單產(chǎn)，多使用高蛋白含量的飼料，這也有可能會提高現(xiàn)代奶牛生鮮乳中孕激素含量；第三，也是最重要一點，現(xiàn)代奶牛繁育中，奶牛出生后90天左右，就對其進行人工授精，取代傳統(tǒng)的自然交配，這使得奶牛妊娠期間持續(xù)泌乳，特別是妊娠后期，奶牛血清中孕激素含量顯著升高，導致牛奶中孕激素含量也隨之升高[12]。據(jù)文獻報道，大約75%牛奶來源于妊娠奶牛[13]。在規(guī)范用藥的前提下，生鮮乳中的激素殘留可忽略不計，但目前我省主要以中小型牧場為主，奶牛飼養(yǎng)農(nóng)戶規(guī)模較小和分散，因此，控制激素使用難度很大。

國家對生鮮乳中孕激素殘留暫無明確規(guī)定，目前也尚無直接證據(jù)證實牛奶中孕激素殘留會對人體健康有不利影響，但學術界和消費者一直很關心和關注牛奶中激素殘留問題，本研究統(tǒng)計和分析了全省44家牧場生鮮乳中孕酮殘留情況，較具有代表性，因此，本研究數(shù)據(jù)可為相關部門制定政策和標準提供依據(jù)和參考[14]。