任波，董佳悅，安太勇，劉美琳，張梅

（成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川成都611137）

厚樸來(lái)源于木蘭科植物厚樸（Magnolia officinalis Rehd.et Wils）或凹葉厚樸（Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.）的干燥干皮、根皮及枝皮。收載于2015年版《中國(guó)藥典》一部，具有燥濕消痰、下氣除滿(mǎn)的功效[1]，臨床上主要應(yīng)用于治療抑郁癥、腸梗阻、慢性肝炎、緩解更年期癥狀等病癥[2-4]?，F(xiàn)代化學(xué)研究表明厚樸中主要化學(xué)成分包括木脂素、揮發(fā)油及生物堿類(lèi)等。藥理研究表明厚樸具有抑菌、抗腫瘤、促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)等作用[5-6]。四川作為厚樸的道地產(chǎn)區(qū)與主要產(chǎn)區(qū)之一，川內(nèi)厚樸種質(zhì)資源遍布了都江堰市、樂(lè)山市（沐川、馬邊等）、阿壩州（松潘、汶川、茂縣等）、雅安、峨眉山市等多個(gè)產(chǎn)地。據(jù)報(bào)道不同品種、不同產(chǎn)地間的厚樸化學(xué)成分組成及含量差異顯著[7-8]。而且同一厚樸中不同類(lèi)型化學(xué)成分相差較大，其中厚樸酚、和厚樸酚成分居首要地位，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于紫丁香苷、木蘭花堿等成分，運(yùn)用單波長(zhǎng)檢測(cè)方法不能全面體現(xiàn)厚樸藥材的整體信息。因此本文采用多波長(zhǎng)切換技術(shù)方法[9-11]，對(duì)四川42個(gè)不同產(chǎn)地厚樸（二十年樹(shù)齡左右）建立高效液相色譜法（high efficiency liquid chromatography，HPLC）指紋圖譜，同時(shí)測(cè)定藥材中厚樸酚、和厚樸酚的含量，以期尋找四川不同產(chǎn)地間厚樸化學(xué)成分及含量的異同，為全面控制和評(píng)價(jià)四川木蘭科植物厚樸的質(zhì)量提供合理依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀（包括Agilent 1200四元泵、Agilent 1200色譜工作站、DAD檢測(cè)器）：美國(guó)Agilent公司；BSA224S型電子分析天平、BP211D型電子天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；2004A版中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)：國(guó)家藥典委員會(huì)；KQ－500DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 樣品及試劑

厚樸酚（Magnolol，MUST－14072405）、和厚樸酚（Honokiol，MUST－14092818）、木蘭花堿（magnoflorine，MUST-14122416）、紫丁香苷（syringin，MUST-15021504）對(duì)照品，純度均≥98%：成都曼斯特生物科技有限公司；乙腈為色譜純：美國(guó)Fisher公司；其他試劑均為分析純：成都市科龍化工試劑廠(chǎng)；純凈水（Milli－Q純水制備系統(tǒng)制備，0.45 μm濾膜濾過(guò)）。

1.3 藥材

42份厚樸樣品分別從四川都江堰、峨眉山、樂(lè)山、雅安及眉山等地收集，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定系裴瑾教授鑒定，所有樣品均為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalis Rehd.et Wils的干燥干皮、根皮及枝皮。厚樸藥材來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 厚樸（Magnolia officinalis Rehd.et Wils）藥材來(lái)源Table 1 Magnolia（Magnolia officinalis Rehd.et Wils）officinalis source

續(xù)表1 厚樸（Magnolia officinalis Rehd.et Wils）藥材來(lái)源Continue table 1 Magnolia（Magnolia officinalis Rehd.et Wils）officinalis source

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：InertSustain C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫 0～5 min，5%A；5 min～20 min，5%～20%A；20 min～30 min，20%～70%A；30 min～50 min，70%～90%A；50 min～60 min，90%～5%A；體積流量 0.8 mL/min；柱溫 35 ℃，進(jìn)樣量 20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm（0～31 min，木蘭花堿、紫丁香苷）、294 nm（31 min～60 min，厚樸酚、和厚樸酚）。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取對(duì)照品厚樸酚、和厚樸酚，紫丁香苷、木蘭花堿適量，加70%的甲醇配制成厚樸酚1.560 g/L、和厚樸酚2.000 g/L、紫丁香苷1.530 g/L、木蘭花堿1.295 g/L對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述對(duì)照品溶液2.5、0.5、0.5、1 mL 置于 5 mL 容量瓶中，加 70%甲醇定容至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取厚樸粉末（過(guò)三號(hào)篩）1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇40 mL，稱(chēng)重，密封，超聲輔助提取40 min，放冷，稱(chēng)重，加70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，即得。

2.4 四川不同產(chǎn)地厚樸高效液相色譜法指紋圖譜的建立

2.4.1 精密度試驗(yàn)

取供試品粉末（S36），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為0.05%～1.13%，0.43%～2.95%，均小于3%，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜測(cè)定相關(guān)要求。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批供試品粉末（S36），平行6份。按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)定HPLC圖譜。計(jì)算其各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面的RSD分別為0.03%～1.21%，1.90%～2.69%，均小于3%，表明重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液（S36），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件在0、2、4、8、16、24h 分別進(jìn)樣行 HPLC 分析。結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD分別為0.05%～2.35%，1.25%～2.58%，均小于3%，表明24 h內(nèi)其穩(wěn)定性良好。

2.4.4 四川不同產(chǎn)地厚樸HPLC指紋圖譜的建立

精密稱(chēng)取42批厚樸粉末，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖，以峰面積大于總峰面積的2%為限度，選取色譜峰作為指紋特征峰。共選取9個(gè)共有峰，通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，在265 nm下，指認(rèn)了2個(gè)共有峰，分別為紫丁香苷（1號(hào)峰）、木蘭花堿（5號(hào)峰）；294 nm時(shí)，標(biāo)記了2個(gè)共有峰，分別為和厚樸酚（8號(hào)峰）、厚樸酚（9號(hào)峰）。其結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2、圖3。

2.4.5 相似度評(píng)價(jià)

采用藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2004A）軟件，將42批四川不同產(chǎn)地厚樸藥材HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入分析，見(jiàn)表2。

得到其指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜之間相似度為0.868～0.990，其中都江堰龍池鎮(zhèn)虹口景區(qū)觀(guān)風(fēng)溝和峨眉山市符溪鎮(zhèn)豐收村相似度較低，分別為0.884和0.868；其余產(chǎn)地厚樸樣品的相似度均在0.9以上，說(shuō)明四川不同產(chǎn)地間厚樸藥材差異較小。

圖1 混合對(duì)照品HPLC指紋圖譜Fig.1 Chromatograms of mixed reference solution

圖2 供試品溶液HPLC指紋圖譜Fig.2 Sample solution of Magnolia officinalis

圖3 42批樣品溶液HPLC指紋圖譜Fig.3 HPLC matched chromatograms for 42 batches of Magnolia officinalis

表2 42批四川不同產(chǎn)地厚樸多波長(zhǎng)切換對(duì)照指紋圖相似度Table 2 Similarity results table of reference fingerprint at different batches of Magnolia officinalis

續(xù)表2 42批四川不同產(chǎn)地厚樸多波長(zhǎng)切換對(duì)照指紋圖相似度Continue table 2 Similarity results table of reference fingerprint at different batches of Magnolia officinalis

2.4.6 指紋圖譜聚類(lèi)分析

選取42個(gè)四川不同產(chǎn)地厚樸多波長(zhǎng)切換指紋圖譜4個(gè)共有峰相對(duì)峰面積為變量，得到42×4階原始數(shù)據(jù)矩陣，運(yùn)用SPSS 19.0軟件，采用中位數(shù)聚類(lèi)法，以?shī)A角余弦為樣品相似度的距離公式對(duì)藥材進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，聚類(lèi)分析結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，四川不同產(chǎn)地厚樸藥材被分為三大類(lèi)，第一類(lèi)包括：S1；第二類(lèi)包括：S5；第三類(lèi)包括：S2、S3、S4、S5、S6、S7、7S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15、S16、S17、S18、S19、S20、S21、S22、S23、S24、S25、S26、S27、S28、S29、S30、S31、S32、S33、S34、S35、S36、S37、S38、S39、S40、S41、S42。通過(guò)聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，四川各產(chǎn)地厚樸藥材之間的相關(guān)性與相似度分析結(jié)果較為一致。

圖3 42批厚樸樣品聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖Fig.3 Dendrogram of cluster analysis for 42 batches of Magnolia officinalis

2.5 厚樸中厚樸酚、和厚樸酚的含量測(cè)定

2.5.1 精密度考察

精密吸取同一供試品溶液（S36），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6次。厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD分別為1.58%，1.41%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性考察

取同一批供試品粉末（S36），平行6份。按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)定HPLC圖譜。厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD分別為1.86%、0.03%，均小于3%，表明重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性考察

精密吸取同一供試品溶液（S36），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件在 0、2、4、8、16、24 h 分別進(jìn)樣行 HPLC 分析。厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD分別為1.96%、2.34%，均小于3%，表明24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

分別將2.2項(xiàng)下的厚樸酚、和厚樸酚的對(duì)照品溶液，用70%的甲醇逐級(jí)稀釋?zhuān)玫胶駱惴淤|(zhì)量濃度分別為 1.560、1.365、1.170、0.585、0.390、0.195 g/L；和厚樸酚質(zhì)量濃度分別為 1.000、0.800、0.400、0.100、0.050、0.025 g/L的系列混合對(duì)照品溶液；分別吸取20 μL注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣檢測(cè)。以質(zhì)量濃度（X，g/L）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，得回歸方程。厚樸酚的回歸方程為Y=35.742X-715.94（r=0.999 9），在0.195 g/L～1.560 g/L范圍內(nèi)其濃度與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系；和厚樸酚的回歸方程為Y=41.821X+70.081（r=0.999 3），在0.025 g/L～1.000 g/L范圍內(nèi)其濃度與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn)

稱(chēng)取厚樸樣品（S36）6份，每份0.1 g，精密稱(chēng)定。分別精密加入與樣品中厚樸酚、和厚樸酚含量相當(dāng)?shù)暮駱惴?.12 mg、和厚樸酚0.8 mg對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算平均回收率。結(jié)果厚樸酚、和厚樸酚的平均回收率分別為97.17%，96.41%；RSD分別為2.98%、2.56%。表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.5.6 樣品的測(cè)定

取42批四川不同產(chǎn)地厚樸粉末1 g，精密稱(chēng)定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.5.7 樣品測(cè)定結(jié)果分析

采用HPLC波長(zhǎng)切換方法對(duì)42個(gè)四川不同產(chǎn)地的厚樸進(jìn)行了定量測(cè)定，見(jiàn)表4。

表3 不同產(chǎn)地厚樸中厚樸酚、和厚樸酚含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination of magnolol and honokiol in Magnolia officinalis from different habitats

續(xù)表3 不同產(chǎn)地厚樸中厚樸酚、和厚樸酚含量測(cè)定結(jié)果Continue table 3 Determination of magnolol and honokiol in Magnolia officinalis from different habitats

表4 厚樸酚、和厚樸酚含量藥典方法測(cè)定結(jié)果Table 4 Determination of magnolol and honokiol in Magnolia officinalis by the pharmacopoeia method

厚樸酚含量為8.56 mg/g～36.41 mg/g，和厚樸酚含量為5.29 mg/g～29.17 mg/g。厚樸酚、和厚樸酚總含量范圍分別為14.36 mg/g～65.58 mg/g，其中除峨眉山市豐收村、茶地村、樂(lè)山市劉溝村、麻柳鄉(xiāng)及阿壩州的厚樸中厚樸酚、和厚樸酚總含量較低外，其他產(chǎn)地中厚樸酚、和厚樸酚總含量均大于2.0%，符合藥典要求。同時(shí)參照《中國(guó)藥典》（2015年版）厚樸含量測(cè)定方法對(duì)S1樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果藥典方法所測(cè)樣品中厚樸酚、和厚樸酚總含量與試驗(yàn)中建立的HPLC方法測(cè)定厚樸酚、和厚樸酚結(jié)果基本一致（表4）。說(shuō)明該方法準(zhǔn)確、有效，適用于川產(chǎn)厚樸中厚樸酚、和厚樸酚定量測(cè)定。

3 結(jié)論與討論

3.1 提取條件考察

試驗(yàn)中分別考察甲醇、乙醇兩種提取溶劑，結(jié)果甲醇為提取溶劑時(shí)，峰數(shù)較多，峰形較好；對(duì)60%、70%、100%的甲醇進(jìn)行考察，結(jié)果以70%甲醇為提取溶劑時(shí)，各主要色譜峰峰面積較大，信息較豐富，故選用70%的甲醇為提取溶劑。對(duì)超聲、回流兩種提取方式進(jìn)行考察，得到的供試液的HPLC色譜無(wú)明顯差異，由于超聲操作較方便，故選擇超聲提取。對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行考察，結(jié)果表明40 min后各時(shí)間提取率基本一致，故選擇超聲時(shí)間為40 min。

3.2 洗脫條件的考察

試驗(yàn)中對(duì)甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-0.1%磷酸水等4個(gè)系統(tǒng)的流動(dòng)相考察，最終確定在乙腈-0.1%磷酸水作為流動(dòng)相條件下，分離度較好，且基線(xiàn)穩(wěn)定，有利于指紋圖譜分析，因此采用乙腈-0.1%磷酸水作為流動(dòng)相系統(tǒng)。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的考察

試驗(yàn)通過(guò)使用DAD檢測(cè)器在波長(zhǎng)190 nm～400 nm紫外區(qū)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，測(cè)定其最大吸收波長(zhǎng)分別為紫丁香苷265 nm、木蘭花堿265 nm，厚樸酚294 nm，和厚樸酚294 nm?；诟鞒煞肿畲笪詹ㄩL(zhǎng)不同，且厚樸中厚樸酚、和厚樸酚含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他成分，為確保厚樸藥材指紋圖譜的全面性，減少含量差異顯著帶來(lái)的干擾，本試驗(yàn)采取HPLC波長(zhǎng)切換技術(shù)測(cè)定厚樸藥材的HPLC指紋圖譜及厚樸酚、和厚樸酚的含量測(cè)定。

本試驗(yàn)建立的指紋圖譜較文獻(xiàn)有一定的進(jìn)步。本試驗(yàn)中首次應(yīng)用多波長(zhǎng)切換技術(shù)對(duì)42批四川不同產(chǎn)地厚樸樣品進(jìn)行HPLC指紋圖譜的測(cè)定，在四川厚樸藥材中共標(biāo)定9個(gè)共有峰，通過(guò)對(duì)照品比對(duì)，對(duì)其中紫丁香苷、木蘭花堿、厚樸酚、和厚樸酚4個(gè)共有峰進(jìn)行了指認(rèn)，完善了厚樸指紋圖譜的信息。結(jié)合相似度計(jì)算和聚類(lèi)分析對(duì)指紋圖譜進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)四川各產(chǎn)地厚樸藥材之間的相關(guān)性與相似度分析結(jié)果較為一致，42批厚樸樣品HPLC色譜圖相似度為0.868～0.990，說(shuō)明各產(chǎn)地厚樸中成分組成差異較小。

本試驗(yàn)對(duì)不同產(chǎn)地厚樸中厚樸酚、和厚樸酚的總含量分析可知，其范圍在14.36 mg/g～65.58 mg/g，各個(gè)產(chǎn)地含量差異顯著。厚樸酚、和厚樸酚作為厚樸中主要活性成分之一，據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)量濃度的厚樸酚、和厚樸酚對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系HONE1進(jìn)行處理，濃度越大，對(duì)HONE1抑制效果更明顯；在雙向調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)，肝臟保護(hù)等多方面的作用，發(fā)現(xiàn)厚樸酚（0.3 μmol/L～30 μmol/L） 可劑量依賴(lài)性增加回腸縱行肌收縮的頻率和振幅。此外和厚樸酚對(duì)致齲菌產(chǎn)酸均有一定的抑制作用，且隨著藥物濃度增加，抑制作用增強(qiáng)[12-14]。證明了厚樸酚、和厚樸酚的含量對(duì)調(diào)整胃腸運(yùn)動(dòng)、抗菌、抗炎、抗腫瘤方面呈一定的量-效關(guān)系。因此提示我們?cè)谠u(píng)價(jià)厚樸藥材質(zhì)量時(shí)，不僅要符合藥典規(guī)定，還需關(guān)注厚樸酚、和厚樸酚含量對(duì)其藥效作用的影響，從而建立厚樸中厚樸酚、和厚樸酚總含量的有效范圍，為全面評(píng)價(jià)四川厚樸藥材的質(zhì)量提供合理的參考。