薛瑩，徐先順，雍莉，林奕希，周銀穎，謝靜，*

（1.四川省疾病預(yù)防控制中心，四川成都610041；2.成都醫(yī)學(xué)院四川養(yǎng)老與老年健康協(xié)同創(chuàng)新中心，四川成都610083；3.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川成都610083）

楊梅（Myrica rubra（Lour.）S.et Zucc.，英文名Waxberry），原產(chǎn)我國浙江余姚，目前主產(chǎn)區(qū)為江南地區(qū)，在湖南、廣東、廣西、貴州等多個(gè)省市也有分布。楊梅是我國傳統(tǒng)的特產(chǎn)水果，富含花青素及其糖苷、黃酮及其糖苷和酚酸等成分[1-4]，不但營養(yǎng)價(jià)值豐富，還具有增強(qiáng)免疫力、調(diào)整腸胃功能、降血糖、降血脂、抗衰老、抗突變、抗腫瘤和增加血小板數(shù)量等功效[5]。國內(nèi)外對楊梅化合物成分研究都僅僅是分別對某幾個(gè)化合物進(jìn)行了分析，尚未進(jìn)行楊梅中功能活性成分的全面檢測。

電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），作為一種軟電離的質(zhì)譜離子源，可以產(chǎn)生較多的分子離子碎片，有助于化合物結(jié)構(gòu)的解析，已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定研究[6-11]。在多種質(zhì)量分析器中，飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF/MS）具有高質(zhì)量精度、高靈敏度、高分辨率等優(yōu)點(diǎn)，可測定復(fù)雜基質(zhì)中化合物的精確質(zhì)量數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)化合物的定性確認(rèn)。同時(shí)TOF/MS還具有高掃描速度的優(yōu)勢，使得其對檢測化合物的數(shù)量幾乎無限制，從而實(shí)現(xiàn)大量化合物的同時(shí)篩查。利用色譜的分離能力，通過化合物的精確質(zhì)量數(shù)與保留時(shí)間數(shù)據(jù)，并結(jié)合二級(jí)碎片分析，可實(shí)現(xiàn)同分異構(gòu)體鑒定，因此，LC-TOF/MS已被廣泛應(yīng)用于食品中化學(xué)成分[12]、農(nóng)藥殘留[13]、獸藥殘留[14]等的篩查與確證中。為了全面確定楊梅中所含功能活性成分的情況，為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)，本課題充分結(jié)合利用UPLC快速分離和Q-TOF/MS準(zhǔn)確定性優(yōu)勢，結(jié)合參考文獻(xiàn)，對楊梅中的小分子活性化合物進(jìn)行了UPLC-ESI-Q-TOF/MS定性篩查。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

JP-020超聲波清洗器：深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；GA110分析天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；移液器：大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司；Heidolph勻漿機(jī)：德國SilentCrusher公司；Milli-Q型超純水儀：美國MILLIPORE公司；0.22 μm濾膜：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司；含SIL-30AC自動(dòng)進(jìn)樣器、LC-30AD泵和CTO-30A柱溫箱的島津超高效液相色譜：日本島津株式會(huì)社；TripleTOFR4600四級(jí)桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜：美國AB Sciex公司；其它試劑均為分析純：成都市科龍化工試劑廠；楊梅樣品：市售。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱為AgilentZORBAXSB-Aq（3.0mm×100mm，1.8 μm）。流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A相）、乙腈（B相），流速為 0.3 mL/min，梯度洗脫：0～5 min保持 5%B，5 min～30 min從 5%B 線性上升至 20%B，30 min～40 min從20%B線性上升至70%B，40 min～41 min從70%B線性上升至90%B，41 min～45 min保持90%B，45 min～46 min從 90%B 線性下降至 5%B，46 min～50 min保持5%B；柱溫為35℃。精密吸取對照品溶液2 μL，注入超高效液相色譜儀，測定。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離正離子模式儀器參數(shù)：毛細(xì)管電壓為5 000 V，霧化氣為345 kPa，輔助氣為345 kPa，氣簾氣為241 kPa，霧化溫度為500℃，去簇電壓為80 V，碰撞能為10 eV，全掃描質(zhì)核比范圍為m/z 100～1 000，并采用APCI Positive Calibration Solution對儀器質(zhì)量精度進(jìn)行實(shí)時(shí)校正。

電噴霧電離負(fù)離子模式儀器參數(shù)：毛細(xì)管電壓為-4 500 V，霧化氣為345 kPa，輔助氣為345 kPa，氣簾氣為241 kPa，霧化溫度為500℃，去簇電壓為-80 V，碰撞能為10 eV，全掃描質(zhì)核比范圍為m/z 100～1 000，并采用APCI Positive Calibration Solution對儀器質(zhì)量精度進(jìn)行實(shí)時(shí)校正。

1.2.3 樣品前處理

將新鮮的楊梅果肉和果核分離后，果肉放入勻漿機(jī)中勻漿，然后精密稱取1 g勻漿后的樣品，至25 mL容量瓶中，加含1%三氟乙酸的甲醇20 mL超聲提取20 min，靜置冷卻至室溫后，用含1%三氟乙酸的甲醇定容至25 mL，搖勻，用0.22 μm的有機(jī)相濾膜過濾，即得待測樣品。

1.2.4 篩查方法

首先，基于楊梅屬植物和常見水果（如草莓、葡萄）中小分子化合物的已有文獻(xiàn)，建立一個(gè)含有100余種相關(guān)化合物的“待篩查化合物數(shù)據(jù)表”。然后在TOF/MS全掃描模式下測定楊梅樣品，通過檢測到的各成分的精確質(zhì)量，運(yùn)用上述“待篩查化合物數(shù)據(jù)表”進(jìn)行檢索，找出可能的化合物。最后在Targeted MS/MS采集模式下進(jìn)行化合物的二級(jí)質(zhì)譜分析，確證相應(yīng)化合物的結(jié)構(gòu)。對于同分異構(gòu)體，再根據(jù)色譜保留時(shí)間（出峰先后順序），參考文獻(xiàn)報(bào)道予以確定，如許多對同分異構(gòu)體，其差別僅僅在于糖基，一個(gè)是半乳糖基，一個(gè)是葡萄糖基，前者出峰較前，后者出峰較后。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析條件的選擇

本試驗(yàn)比較乙腈（甲醇）-水（酸性水溶液）構(gòu)成的多種溶劑洗脫系統(tǒng)，結(jié)果表明乙腈系統(tǒng)中化合物的理論塔板數(shù)更高，而酸性水溶液也可提高峰的對稱性[15]，因此最終采用乙腈-0.1%甲酸水溶液作為洗脫流動(dòng)相。由于本試驗(yàn)待測化合物較多，紫外吸收復(fù)雜，在不同的吸收波長下圖譜差異很大，圖譜不易解讀，故未進(jìn)行紫外檢測，而直接采用TOF/MS全掃描檢測；雖然化合物未實(shí)現(xiàn)基線分離，但由于質(zhì)譜具有分子量提取功能，只需確保UPLC將同分異構(gòu)體分離開即可。本試驗(yàn)還考察了不同的流速（0.2、0.3、0.4 mL/min）和不同的柱溫（25、30、35、40℃）等條件組合，結(jié)果表明，流速和柱溫對化合物出峰時(shí)間及峰形、分離度影響不大。綜合上述篩選，確定分析條件，楊梅樣品的UPLCESI-TOF/MS全掃描總離子流圖如圖1所示。

圖1 楊梅樣品的UPLC-TOF/MS全掃描總離子流圖Fig.1 The total ion current（TIC）chromatogram of Chinese waxberry by UPLC-TOF/MS

2.2 篩查結(jié)果

除了花青素類化合物，本身是正離子狀態(tài)，采用正離子掃描模式進(jìn)行檢測外，其余化合物均采用正負(fù)離子同時(shí)掃描，互為對照。同時(shí)在配合二級(jí)離子碎裂，從而避免假陽性結(jié)果的產(chǎn)生，提高篩查的準(zhǔn)確性。采用1.2.4所述的篩查方法，共從楊梅中篩查出28個(gè)功能活性成分，歸納整理于表1，其中包括13個(gè)黃酮及其糖苷（化合物1～13）、6個(gè)花青素及其糖苷（化合物14～19）和 9個(gè)酚類化合物（化合物 20～28）。

楊梅中含有大量的黃酮苷和花青素苷，并出現(xiàn)了一些同分異構(gòu)體，這些異構(gòu)體的苷元相同，其差別僅僅在于糖基，一個(gè)是半乳糖基，一個(gè)是葡萄糖基。雖然無論是高分辨的精確質(zhì)量數(shù)還是二級(jí)碎裂特征，都無法區(qū)分它們，但是，可以通過色譜保留時(shí)間先后順序進(jìn)行區(qū)分。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，如果是同樣苷元的同分異構(gòu)體糖苷，半乳糖基取代的苷出峰較前，葡萄糖基取代的苷出峰則較后[10]。據(jù)此，對楊梅中的幾對同分異構(gòu)體進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確認(rèn)。楊梅中含有的功能活性成分見表1。

表1 楊梅中含有的功能活性成分Table 1 The active ingredients detected in Chinese waxberry

2.3 黃酮糖苷和花青素糖苷的質(zhì)譜裂解規(guī)律探討

從表1結(jié)果可知，黃酮糖苷和花青素糖苷是楊梅功能活性成分中最多的兩大類化合物，占比約為67%。本研究中發(fā)現(xiàn)黃酮苷元共3種，分別是槲皮素、山奈酚和楊梅素；花青素苷元共4種，分別是飛燕草素、矢車菊素、矮牽牛素和芍藥花色素，其結(jié)構(gòu)如圖2所示。

續(xù)表1 楊梅中含有的功能活性成分Continue table 1 The active ingredients detected in Chinese waxberry

圖2 黃酮苷元和花青素苷元的結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structures of flavone aglycone and anthocyanin aglycone

2.3.1 黃酮苷的質(zhì)譜裂解規(guī)律

除3個(gè)黃酮苷元外，本研究共篩查出10個(gè)黃酮苷類化合物，其二級(jí)質(zhì)譜將首先丟失糖基碎片，黃酮苷在丟失糖基的過程中，會(huì)同時(shí)產(chǎn)生均裂和異裂兩種斷裂方式。楊梅中的黃酮苷均是3-O糖基取代，3-O糖基取代的黃酮苷一個(gè)重要二級(jí)質(zhì)譜裂解特征是均裂碎片豐度大于異裂碎片豐度。以化合物5（楊梅苷，楊梅素-3-O-鼠李糖苷）為例：如圖3 A所示，在負(fù)離子模式下全掃描，化合物5的分子離子峰是m/z 463[MH]-；圖3 B為二級(jí)碎裂圖譜，可見化合物的分子離子峰m/z 463[M-H]-丟失鼠李糖基碎片后，分別產(chǎn)生一個(gè)均裂碎片峰m/z 316（[Yo-H]-·）和一個(gè)異裂碎片峰m/z 317（Yo-），但 m/z 316 的豐度明顯大于 m/z 317；進(jìn)一步，m/z 316還產(chǎn)生了典型的m/z 287[Y0-H-CO-H]－碎片峰和m/z 271[Y0-H-CO-OH]－碎片峰。這一結(jié)果與文獻(xiàn)所報(bào)道的3-O糖基取代黃酮苷裂解規(guī)律完全一致[16-17]。楊梅素-3-O-鼠李糖苷的質(zhì)譜碎裂圖及裂解示意圖如圖3所示。

圖3 楊梅素-3-O-鼠李糖苷的MS圖、MS2圖和裂解示意圖Fig.3 Typical negative ion mass spectra of myricitrin（full scan；MS2），and proposed fragmentation pathway of myricitrin

2.3.2 花青素苷的質(zhì)譜裂解規(guī)律

花青素是酚類化合物中的類黃酮類，為水溶性色素，廣泛存在于植物花瓣、果實(shí)的組織中及莖葉的表面細(xì)胞與下表皮層。在自然狀態(tài)下，花青素在植物體內(nèi)常與各種單糖結(jié)合形成糖苷，形成花青素苷?；ㄇ嗨剀疹惢衔锉旧韼д姾?，因此負(fù)離子掃描不出峰。在ESI離子源質(zhì)譜碎裂時(shí)，首先將得到一個(gè)丟失糖的碎片峰，以化合物16（芍藥花色素-3-O-葡萄糖苷）為例說明：在正離子模式下全掃描，化合物16的分子離子峰是m/z 463[M]+（圖4 A），分子離子峰m/z 463[M]+丟失葡萄糖后，產(chǎn)生一個(gè)丟失162碎片MS2峰m/z 301[M-glc]+，由于芍藥花色素苷元具有3’-OCH3結(jié)構(gòu)，因此還同時(shí)產(chǎn)生了進(jìn)一步丟失CH3碎片的碎片峰m/z 286[M-glc-CH3]+（圖4 B）。芍藥花色素-3-O-葡萄糖苷的MS圖、MS2圖譜及其裂解機(jī)理如圖4所示。

圖4 芍藥花色素-3-O-葡萄糖苷的MS圖、MS2圖和裂解示意圖Fig.4 Typical positive ion mass spectra of petunidin-3-O-glucoside（full scan；MS2），and proposed fragmentation pathway of petunidin-3-O-glucoside

3 結(jié)論

本研究建立無需標(biāo)準(zhǔn)品對照快速篩查楊梅中功能活性成分的超高效液相色譜－四級(jí)桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-ESI-Q-TOF/MS）檢測方法，全面研究楊梅中的活性成分種類。運(yùn)用該方法靈敏、快速、準(zhǔn)確地從市售楊梅樣品中共鑒定出28個(gè)功能活性成分，其中包括13個(gè)黃酮及其糖苷、6個(gè)花青素糖苷和9個(gè)酚類化合物；同時(shí)，本研究還對楊梅中的黃酮苷和花青素苷的質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行探討，進(jìn)一步對化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證。通過此項(xiàng)工作，對全面篩查楊梅中可能含有的活性化合物種類，為基于楊梅的功能食品和保健食品開發(fā)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。