游淑珠，王小玉，蔡教英，姚麗鋒，唐食明，馮家望，丁琦，符家忍

（珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東珠海519000）

大腸埃希氏菌（Escherichia coli，E.coli）俗稱大腸桿菌，具有對極酸性環(huán)境耐受數(shù)小時的能力使之能夠通過動物的胃進(jìn)入腸道生存并繁殖，成為人和溫血動物腸道中的正常棲居菌[1-2]。部分大腸埃希氏菌中能引起人類以腹瀉癥狀為主的食源性疾病，統(tǒng)稱為致瀉大腸埃希氏菌（diarrheagenic E.coli，DEC）。DEC可分為6大類：腸道致病性大腸埃希氏菌（enteropathogenic E.coli，EPEC）、腸道侵襲性大腸埃希氏菌（enteroinvasive E.coli，EIEC）、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌（enterotoxigenic E.coli，ETEC）、腸道集聚性大腸埃希氏菌（enteroaggregative E.coli，EAEC）、擴(kuò)散附著大腸埃希氏菌（diffusely adherent E.coli，DAEC）和產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌為（shigatoxin-producing E.coli，STEC）。STEC 中部分菌株可在臨床上引起人類出血性結(jié)腸炎或出血性腹瀉，并可進(jìn)一步發(fā)展為溶血性尿毒綜合征，即為腸道出血性大腸埃希氏菌（enterohemorrhagic E.coli，EHEC），EHEC在世界上許多國家相繼發(fā)生了暴發(fā)和流行，其流行已成為全球性的公共衛(wèi)生問題之一[1]。

血清型是E.coli分類的最常用方法，E.coli血清型種類繁多，E.coli的抗原成分復(fù)雜，可分為菌體抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K），其中 O 抗原是血清分型的基礎(chǔ)，有一百七十多種[3]。目前發(fā)現(xiàn)的致瀉大腸埃希氏菌與特定O抗原血清型有一定相關(guān)性，不同致瀉大腸埃希氏菌的優(yōu)勢血清型不同，《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》列出了已發(fā)現(xiàn)的EPEC、ETEC、EIEC、EAEC和STEC 5種致瀉大腸埃希氏菌的相關(guān)血清型，E.coli O121 與 EIEC、STEC 相關(guān)[3-7]。

血清分型通過血清凝集試驗實現(xiàn)，但由于血清交叉反應(yīng)、菌體自凝集、菌體表面抗原干擾等影響，E.coli血清型種類繁多，加上分型用血清售價較高、保質(zhì)期短，使得傳統(tǒng)血清分型檢測費用居高不下，準(zhǔn)確度、檢出率、靈敏度不盡如人意，在實際應(yīng)用中大大受限。隨著以PCR技術(shù)為代表的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，E.coli O抗原基因簇基因序列的公布，分子生物學(xué)檢測方法逐漸被成功應(yīng)用于E.coli多種血清型的檢測，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)血清分型的不足，實現(xiàn)了E.coli O抗原血清型的快速、準(zhǔn)確、高效檢測。其在應(yīng)對食品安全重大爆發(fā)事件中其優(yōu)勢充分體現(xiàn)，如2011年5月-7月德國發(fā)生的EHEC O104：H4感染暴發(fā)疫情，波及部分歐洲其他國家及美國、加拿大等國家，HUS報告病例數(shù)表明，這也是迄今為止全球范圍內(nèi)規(guī)模最大的EHEC食源性疾病暴發(fā)事件[8]，當(dāng)時德國負(fù)責(zé)疾病防控與公眾健康的權(quán)威機(jī)構(gòu)——羅伯特·科赫研究所（Robert Koch Institute，RKI）和我國疾病預(yù)防控制中心應(yīng)對這一緊急事件均應(yīng)用了PCR檢測技術(shù)[9-10]。E.coli O121血清型的PCR檢測方法也有相關(guān)報道[7，11-13]。

熒光PCR技術(shù)特異性好、靈敏度高，操作簡便、自動化程度高，可全程動態(tài)監(jiān)控整個PCR反應(yīng)過程，檢測結(jié)果在擴(kuò)增反應(yīng)過程中實時可見，不需電泳和凝膠成像步驟、檢測時間短，正以其無可取代的優(yōu)勢被廣泛用于微生物檢測領(lǐng)域，二十一世紀(jì)以來被逐步推廣應(yīng)用生物學(xué)研究、食品檢測、環(huán)境檢測、醫(yī)學(xué)檢測與診斷等行業(yè)[14]。

本研究以E.coli O121為檢測對象針對其O抗原基因簇的vioA基因建立了其血清型特異性熒光PCR檢測方法。通過對所建方法的靈敏度、特異性進(jìn)行驗證，確定了所建方法對食品中E.coli O121快速檢測的適用性和可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

E.coli O121（菌種編號：ATCC BAA-2190）、E.coli O26（菌種編號：ATCC 12795）、E.coli O45（菌種編號：ATCC BAA-2469）、E.coli O103 （菌種編號：ATCC 23982）、E.coli O111 （菌種編號：ATCC 43887、ATCC 29552、ATCC 33780）、E.coli O145 （菌種編號：ATCC BAA-2216）、E.coli（菌種編號：ATCC 700078、ATCC 10798、ATCC 13706、ATCC 15597、ATCC 11229）：美國典型菌種保藏中心；E.coli O8（菌種編號：ETEC O8）、E.coli O78（菌種編號：ATCC 35401）、E.coli O78（菌種編 號 ：ETEC O78）、E.coli O124 （菌種編號：ATCC 43893）：黑龍江檢驗檢疫局提供；E.coli O4（菌種編號：EC O4）、E.coli O104（菌種編號：EC O104）：珠海出入境檢驗檢疫局保健中心提供；E.coli O157（菌種編號：CCTCC AB 200051）、E.coli（菌種編號：CCTCC AB 200068）、腸炎沙門氏菌（菌種編號：CCTCC AB 94018）、金黃色葡萄球菌（菌種編號：CCTCC AB 91053）、銅綠假單孢菌（菌種編號：CCTCC AB 91095）、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（菌種編號：CCTCC AB 97021）：中國典型培養(yǎng)物保藏中心；E.coli O157（菌種編號：NCTC 12900）、E.coli（菌 種編號：CMCC（B）44102）、金黃色葡萄球菌（菌種編號：CMCC（B）26003）、表皮葡萄球菌（菌種編號：CMCC（B）26069）、藤黃微球菌（菌種編號：CMCC（B）28001）、阪崎腸桿菌（菌種編號：ATCC 51329）、副溶血性弧菌（菌種編號：ATCC 17802）、乙型溶血性鏈球菌（菌種編號：CMCC（B）32210）、枯草芽孢桿菌（菌種編號：CMCC（B）63501）、糞腸球菌（菌種編號：CMCC（B）32220）、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（菌種編號：CMCC（B）52204）、變形桿菌（菌種編號：CMCC（B）49027）、肺炎克雷伯氏菌（菌種編號：CMCC（B）46101）、福氏志賀氏菌（菌種編號：CMCC（B）51571）、宋內(nèi)氏志賀氏菌（菌種編號：CMCC（B）51334）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；空腸彎曲菌（菌種編號：ATCC 33291）：美國 Microbiologics公司；嗜酸乳桿菌（菌種編號：CGMCC 1.1878）：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。

1.1.2 培養(yǎng)基、試劑與溶液

EC肉湯：北京陸橋技術(shù)有限公司；Premix Ex Taq（Probe qPCR）試劑盒、DNA Marker：日本 TAKARA 公司；DNA提取試劑盒（離子柱型）DP 302：北京天根生化科技有限公司；DNA裂解液：珠海科登生物工程有限公司。

1.1.3 引物、探針

在www.ncbi.nlm.nlh.gov網(wǎng)站上檢索的來源不同的E.coli O121的O抗原基因簇序列（GenBank序列號 ：AY208937、JN859209-JN859220），DNAMAN 軟 件比對，根據(jù)vioA基因高保守區(qū)的基因序列，利用Oligo7.0軟件設(shè)計引物、探針。上游引物：5’-ATCCGAGAAGAATTGAAGA-3’、下游引物：5’-CATG －GAAACTTAAGACACTTA-3’、探針：5’-JOE-AACACTTCCATCATCATCTTCAACG C-TAMRA-3’，均委托上海Invitrogen公司合成。引物對和探針分別用無菌超純水稀釋到儲備濃度100 μmol/L，-20℃保存，臨用時無菌超純水稀釋至10 μmol/L。

1.1.4 樣品

畜肉196份：市場上采購；水產(chǎn)品46份、禽產(chǎn)品43份、可生食蔬菜54份：珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心受理的委托檢驗樣品。

1.2 儀器與設(shè)備

核酸濃度測定儀（ND-1000）：美國NanoDrop公司；離心機(jī)（Minispin Plus）：德國 Eppendorf公司；熒光PCR儀（7500Fast）：美國ABI公司；拍擊式均質(zhì)器（AES Smasher）：法國Biomerieux公司；恒溫培養(yǎng)箱（1565-2E）：美國SHELLAB公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌DNA模板的提取、濃度及純度的測定

指數(shù)期生長各菌株菌液，用DNA提取試劑盒并按其說明提取制備DNA模板。使用核酸濃度測定儀測定出DNA的濃度，OD260/OD280比值在1.7～1.9之間時，適用于PCR擴(kuò)增。

1.3.2 熒光PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

反應(yīng)體系：體積為 25 μL；2× Premix Ex Taq（Probe qPCR）12.5μL、引物對（10μmol/L）1μL、探針（10μmol/L）1 μL、50×ROX Reference Dye II 0.5 μL、模板 2 μL、無菌超純水 8 μL。

反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性15 s，60℃退火30 s，收集熒光，40個循環(huán)。

1.3.3 熒光PCR特異性試驗

用DNA提取試劑盒分別提取各菌株的DNA模板，按上述條件進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，驗證熒光PCR方法的特異性。

1.3.4 熒光PCR靈敏度試驗

將提取的E.coli O121的DNA進(jìn)行10倍連續(xù)遞增稀釋至10-7濃度，將原液和各DNA核酸稀釋液分別用相同條件進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，確定熒光PCR方法的靈敏度。

1.3.5 食品樣品的檢測

1.3.5.1 制樣

無菌稱取樣品25 g至帶濾網(wǎng)拍擊式均質(zhì)袋加入225 mL EC肉湯，拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)2 min。

1.3.5.2 增菌

樣品均質(zhì)后于恒溫培養(yǎng)箱36℃培養(yǎng)24 h。

1.3.5.3 核酸提取

培養(yǎng)結(jié)束后，取帶濾網(wǎng)拍擊式均質(zhì)袋中培養(yǎng)物濾過液按熱裂解法提取核酸：1 mL培養(yǎng)物濾過液于1.5 mL離心管12 000 r/min離心5 min，棄上清，加DNA裂解液50 μL，于100℃金屬浴裂解5 min，冷卻后12 000 r/min離心5 min，上清備用。

1.3.5.4 熒光PCR檢測

按1.3.2中的條件進(jìn)行熒光PCR檢測。

1.3.5.5 結(jié)果判定

根據(jù)熒光PCR儀給出的樣品到達(dá)域值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（即Ct值）進(jìn)行樣品結(jié)果判定。Ct值≤35時，判定檢品E.coli O121陽性；Ct值為零或≥37時，判定E.coli O121陰性。Ct值介于35～37之間判斷為可疑，采用5 μL模板量進(jìn)行重復(fù)試驗，如出現(xiàn)指數(shù)期明顯的擴(kuò)增曲線可判定為陽性，否則為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 E.coli O121熒光PCR方法的建立

E.coli O121熒光PCR擴(kuò)增曲線見圖1。

以E.coli O121的O抗原基因簇的vioA基因為靶基因，設(shè)計引物、探針，經(jīng)反應(yīng)體系優(yōu)化，建立了E.coli O121熒光PCR檢測方法，E.coli O121標(biāo)準(zhǔn)菌株呈現(xiàn)出典型的熒光PCR擴(kuò)增曲線，表明該熒光PCR反應(yīng)體系適用于E.coli O121的檢測。

圖1 E.coli O121熒光PCR擴(kuò)增曲線Fig.1 Amplification plot of the real-time PCR method for detection of E.coli O121

圖2 E.coli O121熒光PCR特異性試驗擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplification plot of specificity test of the real-time PCR method for detection of E.coli O121

2.2 E.coli O121熒光PCR方法特異性試驗

E.coliO121熒光PCR特異性試驗擴(kuò)增曲線見圖2。

取1.1.1中所列的E.coli菌株的以及其他菌株的DNA進(jìn)行實時熒光PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，僅E.coli O121擴(kuò)增出陽性增幅曲線，其它非O121 E.coli和非E.coli菌株DNA樣本的檢測結(jié)果均為陰性。據(jù)此可判斷，本研究設(shè)計的E.coli O121檢測引物和探針具有很好的特異性。

2.3 E.coli O121熒光PCR方法靈敏度試驗

E.coli O121菌株的DNA經(jīng)核酸濃度測定儀測得其濃度為31 ng/μL，菌株DNA原液和7個連續(xù)10倍梯度的DNA稀釋液各2 μL用于擴(kuò)增，E.coli基因組大小為0.004 pg/拷貝，菌株DNA原液模板相當(dāng)于15 500 000拷貝，菌株DNA原液和7個連續(xù)10倍連續(xù)遞增稀釋的稀釋液檢測靈敏度試驗擴(kuò)增曲線見圖3。

由圖3可知，本方法的檢測靈敏度可達(dá)155拷貝/反應(yīng)。

2.4 食品樣品檢測

所檢的339份食品樣品中檢出E.coli O121陽性9份，陽性率2.7%，樣品檢測結(jié)果見表1。

表1 食品樣品污染調(diào)查結(jié)果統(tǒng)計分析Table 1 Statistics analysis of food samples pollution survey

結(jié)合樣品來源分析，196份畜肉均為市場上采購獲得的生豬肉和生牛肉，未經(jīng)過食品深加工，檢出樣品E.coli O121陽性8份，陽性率4.1%；水產(chǎn)品、禽產(chǎn)品、可生食蔬菜均為本單位受理的委托檢驗樣品，多數(shù)為經(jīng)過加工的產(chǎn)品，特別是部分水產(chǎn)品和禽產(chǎn)品為深度加工的鮮、凍產(chǎn)品，陽性率較低，46份水產(chǎn)品檢出樣品E.coli O121陽性1份，陽性率2.1%；禽產(chǎn)品43份和可生食蔬菜54份的E.coli O121檢測結(jié)果均為陰性。檢測結(jié)果預(yù)示樣品檢測陽性率與食品基質(zhì)和加工程度存在一定相關(guān)性，食品基質(zhì)營養(yǎng)越豐富、未經(jīng)過加工或只經(jīng)過初加工的產(chǎn)品陽性率相對較高。

3 討論

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以PCR技術(shù)為代表的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)以其特有的快速、準(zhǔn)確、高效等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于分子診斷、分子生物學(xué)研究、動植物檢疫以及食品安全檢測等領(lǐng)域。我國2016版12月發(fā)布并于2017年6月實施的2016版GB 4789系列食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中致瀉大腸埃希氏菌（GB 4789.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗致瀉大腸埃希氏菌檢驗》）、肉毒梭菌（GB 4789.12-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗》）、諾如病毒（GB 4789.42-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗諾如病毒檢驗》）3項食品微生物學(xué)檢驗指標(biāo)也首次將PCR技術(shù)納入強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)方法[4，15-16]，使得標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性、實用性更強(qiáng)。

E.coli O121是重要的致瀉大腸埃希氏菌血清型之一，與致瀉大腸埃希氏菌中EIEC、STEC兩類相關(guān)[3-7]。開展E.coli相關(guān)血清型的分子生物學(xué)檢測方法的研究可有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)血清分型的不足，可實現(xiàn)E.coli O抗原血清型的快速、準(zhǔn)確、高效檢測，尤其利于應(yīng)對食品安全緊急突發(fā)事件，意義重大。GB 4789.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗致瀉大腸埃希氏菌檢驗》給出了致瀉大腸埃希氏菌相關(guān)毒力基因的PCR檢測方法，但血清學(xué)試驗仍采用傳統(tǒng)血清凝集進(jìn)行，E.coli O抗原血清型分子生物學(xué)檢測方法的研究可提供一個良好補(bǔ)充。

本研究選擇E.coli O121的O抗原基因簇的vioA基因的特異性序列為靶序列，進(jìn)行E.coli O121的實時PCR快速檢測方法研究。根據(jù)BLAST分析結(jié)果，所選定的引物、探針序列均與GenBank中的所有E.coli O121對應(yīng)基因序列完全吻合，而與其他基因序列無明顯相關(guān)性。建立的熒光PCR方法對包括E.coli O121在內(nèi)的23株E.coli細(xì)菌和19株非E.coli細(xì)菌進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，其中E.coli O121菌株檢測為陽性，而其他細(xì)菌檢測為陰性，說明引物和探針具有高度特異性。上述引物序列分析以及特異性試驗結(jié)果說明所建立的熒光PCR方法適用于E.coli O121的快速檢測。為確定該方法檢測靈敏度，對已知濃度E.coli O121的提取每個稀釋度細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋后進(jìn)行實時熒光PCR檢測，結(jié)果顯示，原始菌液稀釋至10-5時仍能檢出，表明本檢測方法對E.coli O121的檢測靈敏度可達(dá)0.62 pg/反應(yīng)，即155拷貝/反應(yīng)。

本研究建立的食品中E.coli O121熒光PCR檢測方法用于全程（包括樣品前增菌、核酸提取、熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)）僅需約1.5 d，直接檢測樣品增菌液可在2 h內(nèi)完成，從上機(jī)到得到檢測結(jié)果可在1 h內(nèi)完成，與傳統(tǒng)細(xì)菌分離鑒定方法比較顯著縮短檢測時間。

通過對方法特異性、靈敏度和實際樣品污染的調(diào)查證實，本研究建立的熒光PCR快速檢測方法操作簡便、快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高，縮短檢測周期，可用于食品中E.coli O121的快速檢測。