曹菲菲，康鵬玲，甄潤(rùn)英，*，郝宗鋒

（1.天津市食品研究所有限公司，天津301609；2.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384；3.天津?yàn)I海高新區(qū)衛(wèi)生監(jiān)督所，天津300384）

天然色素安全性高、色澤自然，而且天然色素在疾病預(yù)防和保健方面具有一定的保健功能[1-2]?；ㄉ漳軓?qiáng)烈吸收紫外光，在體內(nèi)起著紫外屏障作用，使細(xì)胞分化和其他生命過(guò)程正常進(jìn)行，同時(shí)能夠預(yù)防冠心病和心肌缺損，推遲癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此是一種具有較好開(kāi)發(fā)與應(yīng)用潛力的天然色素[3-4]。目前以花色苷為主要成分的產(chǎn)品投放到市場(chǎng)，用于緩解使用電腦誘發(fā)的眼疲勞等癥狀[5]。

花色苷作為一種天然食用色素，安全、無(wú)毒，在食品領(lǐng)域有著巨大應(yīng)用潛力[6-7]。宋曉波等[8]在紫甘藍(lán)提取色素研究中，在溫度55℃、以25%乙醇為溶劑、pH=2的條件下，使用微波輔助萃取法，提取功率在100 W～600 W下測(cè)定紫甘藍(lán)色素的吸光度值（A525），隨著微波功率的變化，提取液的吸光度值先逐漸升高而后下降，并在功率為300 W時(shí)呈現(xiàn)最大值；孫雪花等[9]采用超聲波輔助提取法，在以蒸餾水為浸提劑，浸提時(shí)間50 min，液固比為 40 ∶1（mL/g），浸提溫度為 40℃，超聲輔助功率80%時(shí)，浸提效果最優(yōu)。徐亞民等[10]通過(guò)普魯士藍(lán)法來(lái)測(cè)定總還原力，濃度在0～1 mg/mL時(shí)，其還原能力隨著其濃度的增加而增強(qiáng)；張會(huì)香等[11]采用DPPH自由基的清除試驗(yàn)測(cè)定其抗氧化活性，將紫甘藍(lán)鮮樣用0.35 mol/L鹽酸溶液，按液固比4∶1（mL/g）浸提，在微波爐中以900W功率浸提120s后測(cè)吸光度值，當(dāng)紫甘藍(lán)中花色苷濃度在0.05 mg/mL～0.15 mg/mL時(shí)，清除DPPH自由基的清除率隨著濃度的升高而增大，當(dāng)紫甘藍(lán)色素液濃度為0.15mg/mL時(shí)，其清除率最大。

本文以鮮紫甘藍(lán)為原料，采用常規(guī)水浴提取，使用鹽酸水溶液作為提取劑，考察時(shí)間、溫度、提取劑濃度對(duì)浸提效果的影響，進(jìn)而確定最佳提取條件，并進(jìn)一步測(cè)定提取物的抗氧化活性，以期為紫甘藍(lán)色素的充分開(kāi)發(fā)利用奠定一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

新鮮紫甘藍(lán)：購(gòu)于天津市王頂?shù)淌卟伺l(fā)市場(chǎng)。

鹽酸（分析純）：Sigma；三（羥甲基）氨基甲烷（Tri-（ hydroxymethyl）aminomethane，Tris-HCl） 緩沖液、鄰苯三酚溶液、水楊酸-乙醇溶液、FeSO4溶液、抗壞血酸溶液均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ-2B組織搗碎勻漿機(jī)：金壇市榮華儀器制造有限公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DGX-9053B-1電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；YP1002N電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；WFJ7200可見(jiàn)分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫甘藍(lán)處理

稱(chēng)取一定質(zhì)量的新鮮紫甘藍(lán)切塊（長(zhǎng)×寬=2 cm×2 cm），按1∶1（質(zhì)量比）的比例加入蒸餾水放于組織搗碎勻漿機(jī)中，以10 000 r/min速度打漿3 min，取勻漿，備用。

1.3.2 紫甘藍(lán)色素提取的單因素試驗(yàn)

稱(chēng)取一定質(zhì)量的紫甘藍(lán)勻漿，然后選用鹽酸水溶液作為提取劑，考察提取劑的濃度、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)紫甘藍(lán)色素提取效果的影響。

1.3.2.1 鹽酸濃度對(duì)紫甘藍(lán)色素提取的影響

分別稱(chēng)取9份10g紫甘藍(lán)勻漿置于燒杯中，編號(hào)后按勻漿 ∶鹽酸=1 ∶5（體積比）加入濃度 0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mol/L 鹽酸溶液，在 60 ℃水浴鍋中浸提1 h，過(guò)濾后取10 mL濾液，用0.05 mol/L的鹽酸溶液定容至100 mL，搖勻后測(cè)波長(zhǎng)在526 nm下的吸光度值。

1.3.2.2 提取時(shí)間對(duì)紫甘藍(lán)色素提取的影響

分別稱(chēng)取6份10 g紫甘藍(lán)勻漿置于燒杯中，編號(hào)后按勻漿∶鹽酸=1∶5（體積比）加入0.30 mol/L鹽酸溶液，在 60 ℃的水浴鍋中分別浸提 0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，過(guò)濾后取10 mL濾液，用0.05 mol/L鹽酸溶液定容至100 mL，搖勻后測(cè)波長(zhǎng)在526 nm下的吸光度值。

1.3.2.3 提取溫度對(duì)紫甘藍(lán)色素提取的影響

分別稱(chēng)取6份10 g紫甘藍(lán)漿液置于燒杯中，編號(hào)后按勻漿∶鹽酸=1∶5（體積比）加入0.30 mol/L鹽酸溶液，分別在 30、40、50、60、70、80 ℃的水浴鍋中浸提 1 h，過(guò)濾后取10 mL濾液，用0.05 mol/L鹽酸溶液定容至100 mL，搖勻后測(cè)波長(zhǎng)在526 nm下的吸光度值。

1.3.3 正交試驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了三因素三水平的正交試驗(yàn)，以紫甘藍(lán)色素的吸光度值為指標(biāo)，對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，因素及水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Orthogonal test factor level table

1.3.4 提取率計(jì)算

根據(jù)正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)工藝進(jìn)行多次重復(fù)試驗(yàn)，并對(duì)提取物進(jìn)行濃縮、干燥，稱(chēng)量提取物的重量，然后計(jì)算提取率。

式中：A1為提取后樣品吸光度值；A0為提取前的樣品吸光度值。

1.3.5 紫甘藍(lán)色素提取物抗氧化活性試驗(yàn)

1.3.5.1 紫甘藍(lán)色素提取物對(duì)超氧陰離子清除試驗(yàn)

1）鄰苯三酚自氧化法：配制濃度分別為 2、4、6、8、10、12、14、16、18 mg/mL 紫甘藍(lán)色素提取物溶液，進(jìn)行下列抗氧化試驗(yàn)。

2）樣品的測(cè)定過(guò)程：向試管中加入9 mL 50 mmol/L的Tris-Hcl緩沖液，在25℃水浴下保溫10 min后加入1 mL蒸餾水，最后加入250 μL 45 mmol/L鄰苯三酚溶液，立刻計(jì)時(shí)。搖勻后，倒入1 cm比色皿中，測(cè)定波長(zhǎng)在420nm下的吸光度值，記錄為A自氧化，然后用1mL待測(cè)樣品代替1 mL蒸餾水，按上述同樣的方法測(cè)定吸光度值，記錄為A加樣。每個(gè)濃度組平行測(cè)定3次，取其平均值，然后按下式計(jì)算抑制率。

1.3.5.2 紫甘藍(lán)色素提取物對(duì)羥自由基清除試驗(yàn)

1）水楊酸捕捉羥自由基法：配制濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL紫甘藍(lán)色素提取物溶液，進(jìn)行下列抗氧化試驗(yàn)。

2）樣品的測(cè)定過(guò)程：分別向5支試管中加入1 mL 8.8 mmol/L FeSO4、1 mL 9.1 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液、1 mL樣品液和5 mL蒸餾水，再加入1 mL 0.06%H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，立即放入37℃水浴鍋中保溫30 min后，測(cè)定波長(zhǎng)在510nm下的吸光度值，記為A1。用1 mL的蒸餾水代替1 mL的H2O2，按上述同樣的方法測(cè)定吸光度值，記錄為A2。用1 mL蒸餾水代替1 mL樣品，按上述同樣的方法測(cè)定吸光度值，記錄為A3，每個(gè)濃度組平行測(cè)定3次，取其平均值，測(cè)定結(jié)果以清除率表示。

1.3.5.3 IC50的計(jì)算

采用Origin軟件計(jì)算紫甘藍(lán)色素提取物與抗壞血酸對(duì)超氧陰離子及羥自由基清除作用的IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫甘藍(lán)色素提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 鹽酸濃度對(duì)紫甘藍(lán)色素提取的影響

不同鹽酸濃度對(duì)紫甘藍(lán)色素提取效果的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 鹽酸濃度對(duì)紫甘藍(lán)色素提取液吸光度的影響Fig.1 Effect of hydrochloric acid concentration on absorbance of purple cabbage pigment extract

由圖1可知，鹽酸濃度在0～0.2 mol/L時(shí)紫甘藍(lán)色素提取液的吸光值變化不大，在0.2 mol/L～0.25 mol/L時(shí)迅速增大，并且當(dāng)鹽酸濃度為0.25 mol/L時(shí)，紫甘藍(lán)色素提取液的吸光度值達(dá)到最大，隨后呈下降趨勢(shì)，因此選擇濃度為0.25、0.3、0.35 mol/L進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)紫甘藍(lán)色素提取的影響

不同提取時(shí)間對(duì)紫甘藍(lán)色素提取效果的影響結(jié)果，見(jiàn)圖2。

圖2 提取時(shí)間對(duì)紫甘藍(lán)色素提取液吸光度的影響Fig.2 Effect of extraction time on absorbance of purple cabbage pigment extract

由圖2可知，紫甘藍(lán)色素提取液的吸光度在0～0.5 h時(shí)迅速增大，在0.5 h～1.5 h時(shí)紫甘藍(lán)色素提取液的吸光度隨著提取時(shí)間的增加而緩慢增大，但超過(guò)1.5 h后，紫甘藍(lán)色素提取液的吸光度有緩慢下降的趨勢(shì)，因此，選擇1、1.5、2 h進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.3 提取溫度對(duì)紫甘藍(lán)色素提取效果的影響

不同提取溫度對(duì)紫甘藍(lán)色素提取效果的影響，見(jiàn)圖3。

圖3 提取溫度對(duì)紫甘藍(lán)色素提取液吸光度的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on absorbance of purple cabbage pigment extract

由圖3可知，紫甘藍(lán)色素提取液的吸光度在0℃～30℃時(shí)迅速增大，在30℃～60℃時(shí)紫甘藍(lán)色素提取液的吸光度緩慢增大，并且到60℃時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，隨后呈緩慢下降的趨勢(shì)，因此，選擇40、50、60℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

提取工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and result of orthogonal test

根據(jù)表2由極差分析結(jié)果可以看出：對(duì)紫甘藍(lán)色素提取效果的影響因素主次順序依次為：提取溫度＞鹽酸濃度＞提取時(shí)間，即提取溫度是最主要因素，鹽酸濃度是次要因素，提取時(shí)間的影響效果不明顯。根據(jù)正交試驗(yàn)分析得出的最佳組合是A3B3C2，而表中直觀分析得到的最佳組合也是A3B3C2。

通過(guò)計(jì)算得到紫甘藍(lán)色素提取物的提取率為1.67%。

2.3 抗氧化性試驗(yàn)的結(jié)果

2.3.1 不同濃度紫甘藍(lán)色素提取物對(duì)超氧陰離子清除試驗(yàn)

紫甘藍(lán)色素提取物對(duì)超氧陰離子清除效果見(jiàn)圖4。

圖4 紫甘藍(lán)色素提取物對(duì)超氧陰離子的清除能力Fig.4 Scavenging capacity of purple cabbage pigment to superoxide anion

由圖4可知，紫甘藍(lán)色素提取物濃度在0～12mg/mL時(shí)紫甘藍(lán)色素清除超氧陰離子的能力隨著濃度的增加而增大，隨后呈下降趨勢(shì)。

抗壞血酸對(duì)超氧陰離子清除效果見(jiàn)圖5。

圖5 抗壞血酸對(duì)超氧陰離子的清除能力Fig.5 Scavenging ability of ascorbic acid to superoxide anion

由圖5可知，抗壞血酸濃度在0～0.8 mg/mL時(shí)抗壞血酸清除超氧陰離子的能力隨著濃度的增加而增大，隨后呈下降趨勢(shì)。

紫甘藍(lán)色素提取物與抗壞血酸清除超氧陰離子的 IC50，見(jiàn)圖6。

圖6 紫甘藍(lán)色素提取物與抗壞血酸清除超氧陰離子的IC50比較Fig.6 IC50comparison between purple cabbage pigment extract and ascorbic acid scavenging superoxide anion

由圖6可以看出，紫甘藍(lán)色素提取物清除超氧陰離子的IC50=2.301 mg/mL，抗壞血酸清除超氧陰離子的IC50=0.029 35 mg/mL。所以，紫甘藍(lán)色素提取物對(duì)超氧陰離子的清除能力小于抗壞血酸對(duì)超氧陰離子的清除能力。

2.3.2 不同濃度紫甘藍(lán)色素提取物對(duì)羥自由基清除試驗(yàn)

紫甘藍(lán)色素提取物對(duì)羥自由基清除效果見(jiàn)圖7。

圖7 紫甘藍(lán)色素提取物對(duì)羥自由基清除能力Fig.7 Scavenging capacity of purple cabbage pigment extracts to hydroxyl radicals

由圖7可知，濃度在0～0.6 mg/mL的范圍內(nèi)，紫甘藍(lán)色素清除羥自由基的能力隨著濃度的增加而增大，隨后下降并趨于穩(wěn)定。

抗壞血素對(duì)羥自由基清除效果見(jiàn)圖8。

圖8 抗壞血酸對(duì)羥自由基清除能力Fig.8 Scavenging ability of ascorbic acid to hydroxyl radicals

由圖8可知，濃度在0～0.8 mg/mL時(shí)，抗壞血酸清除羥自由基的能力隨著濃度的增加而增大，到0.8mg/mL后下降。

紫甘藍(lán)色素提取物與抗壞血酸清除羥自由的IC50，見(jiàn)圖9。

圖9 紫甘藍(lán)色素提取物與抗壞血酸清除羥自由的IC50Fig.9 Purple cabbage pigment extract and ascorbic acid scavenging hydroxyl free IC50

圖9可以看出，紫甘藍(lán)色素提取物清除氫自由基的IC50=0.956 9 mg/mL，抗壞血酸清除氫自由基的IC50=0.046 76 mg/mL。所以，抗壞血酸清除羥自由基的能力要比紫甘藍(lán)色素提取物的清除能力強(qiáng)。

2.3.3 抗氧化試驗(yàn)的結(jié)果討論

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，提取物對(duì)羥自由基的清除作用比較強(qiáng)，而對(duì)超氧陰離子的清除作用比較弱。此外，在相對(duì)較低的濃度下，紫甘藍(lán)色素提取物對(duì)超氧陰離子和氫自由基的清除作用隨著其濃度的增加而明顯增強(qiáng)，但是達(dá)到一定濃度后對(duì)超氧陰離子和氫自由基的清除效果呈緩慢下降趨勢(shì)。這是因?yàn)榭寡趸瘎┍旧順O易被氧化，若添加過(guò)量，被氧化了的抗氧化劑反而可能有助氧化的作用[12-14]。因此，如果作為天然抗氧化劑在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用時(shí)，要選擇適宜的劑量范圍，以達(dá)到最佳的抗氧化效果。

3 結(jié)論與討論

3.1 提取條件對(duì)紫甘藍(lán)色素提取率的影響

鹽酸濃度：花色苷在pH≤3的酸性條件下穩(wěn)定，而當(dāng)pH值升高時(shí)，花色苷會(huì)轉(zhuǎn)化為醇型假堿式結(jié)構(gòu)，若pH值再提高，則會(huì)導(dǎo)致假堿開(kāi)環(huán)降解，尤其當(dāng)pH＞7時(shí)，極不穩(wěn)定[15]。因此，紫甘藍(lán)色素適合在酸性條件下浸提。

提取溫度：在溫度升高的一定范圍內(nèi)，花色苷會(huì)向吡喃陽(yáng)離子轉(zhuǎn)變，而當(dāng)溫度繼續(xù)升高的時(shí)，花色苷極不穩(wěn)定，因?yàn)楦邷貢?huì)促使花色苷向假堿式轉(zhuǎn)變以致開(kāi)環(huán)降解[16]。因此，隨著溫度的變化，紫甘藍(lán)色素提取液的吸光值先逐漸升高，然后下降。

提取時(shí)間：隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)，紫甘藍(lán)色素的提取量逐漸增加，且在1.5 h時(shí)達(dá)到最大，出現(xiàn)這種結(jié)果可能是因?yàn)樵诙虝r(shí)間內(nèi)，60℃保溫淀粉不會(huì)糊化，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)淀粉也會(huì)出現(xiàn)糊化現(xiàn)象，淀粉糊化影響花色苷的溶出，從而影響提取效率[12]。

3.2 最終工藝條件的確定

根據(jù)表2正交試驗(yàn)結(jié)果，直觀分析和極差分析即提取溫度60℃，提取時(shí)間2 h，鹽酸濃度為0.3 mol/L的條件下，紫甘藍(lán)色素的提取率為1.67%。

3.3 結(jié)論

1）以新鮮紫甘藍(lán)勻漿[紫甘藍(lán) ∶水=1 ∶1（g/mL）]∶鹽酸=1∶5（體積比）加入0.3 mol/L的鹽酸溶液，在60℃下浸提2 h，紫甘藍(lán)色素的提取率為1.67%。

2）在濃度0～12 mg/mL范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，紫甘藍(lán)色素提取物對(duì)超氧陰離子的清除能力增強(qiáng)，對(duì)超氧陰離子清除能力的IC50為2.301 mg/mL。

3）在濃度0～0.6 mol/mL的范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，紫甘藍(lán)色素提取物對(duì)羥自由基的清除能力增強(qiáng)，對(duì)氫自由基清除能力的IC50為0.956 9 mg/mL。

4）紫甘藍(lán)色素提取物對(duì)氫自由基的清除效果強(qiáng)于超氧陰離子的清除效果。