周婧琦，羅雙群，*，王晶晶，高愿軍

（1.漯河食品職業(yè)學(xué)院，河南漯河462300；2.鄭州輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450000）

黃秋葵是近年來(lái)在我國(guó)流行起來(lái)的一種高營(yíng)養(yǎng)保健蔬菜，其果實(shí)口感柔滑，富含蛋白質(zhì)和脂肪，可供炒、涼拌、煲湯，工業(yè)生產(chǎn)也可將其做成秋葵醬、罐頭、腌菜等風(fēng)味產(chǎn)品[1]。國(guó)內(nèi)外研究表明，秋葵還具有抗疲勞、抗氧化、提高人體免疫能力等保健功效[2-4]。

黃酮類物質(zhì)是一類含有酚羥基的還原性物質(zhì)，酚羥基結(jié)構(gòu)可提供質(zhì)子和電子，與自由基反應(yīng)，生成半醌式自由基[5]，從而中斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，不管是在生物體內(nèi)或是體外均有很強(qiáng)的抗氧化性，秋葵具有的保健功效與其中所含有的黃酮類物質(zhì)密切相關(guān)。為了從秋葵中提取純度較高的黃酮類物質(zhì)，分離純化是關(guān)鍵步驟。目前黃酮類化合物的分離純化方法主要有樹(shù)脂吸附法、超濾法、層析法、金屬試劑絡(luò)合沉淀法等。而大孔吸附樹(shù)脂優(yōu)勢(shì)突出，其吸附量大且被吸附物質(zhì)易于洗脫，穩(wěn)定性高，材料環(huán)保，可再生，能重復(fù)使用，但其在秋葵黃酮的分離純化鮮有報(bào)道[6]，因此利用大孔樹(shù)脂分離純化秋葵黃酮具有重要價(jià)值。本文利用4種大孔樹(shù)脂對(duì)秋葵黃酮進(jìn)行分離純化，確定最優(yōu)純化工藝條件，并通過(guò)體外抗氧化試驗(yàn)，測(cè)定秋葵黃酮的還原力及·OH、O2-·、DPPH·、ABTS+·的清除能力，以期為天然抗氧化劑開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秋葵：鄭州市緯三路蔬菜批發(fā)市場(chǎng)華玉蔬菜商行；大孔樹(shù)脂 AB-8、NKA-9、HPD-400、D4020：鄭州華溢科技新材股份有限公司；其余試劑均為分析純。

XY-FD-18真空冷凍干燥機(jī)：上海欣諭儀器有限公司；RRHP-100型萬(wàn)能高速粉碎機(jī)：歐凱萊芙香港實(shí)業(yè)公司；SB-5200DT超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；WBFY-205微電腦微波化學(xué)反應(yīng)器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療器械廠；HC-3618R高速冷凍離心機(jī)：安徽中科科學(xué)儀器有限公司；752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；HL-2恒流泵：上海青浦滬西儀器廠；DBS-100電腦全自動(dòng)部份收集器：上海嘉鵬科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 秋葵黃酮粗樣液的制備

挑選大小均勻的秋葵嫩莢，切2 mm薄片，真空冷凍干燥24 h，粉碎后過(guò)100目篩，然后以60%乙醇溶液為提取劑，采用超聲微波聯(lián)用法在微波功率550 W，液料比 1 ∶50（g/mL），超聲 30 min，微波 60 s條件下提取秋葵中黃酮類化合物，提取后在8 500 r/min下離心5 min，將上清液在45℃下旋蒸濃縮得粗提物浸膏。

1.2.2 總黃酮含量測(cè)定

將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在108℃下烘干至恒重并精確稱取10 mg，用70%乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，得到100 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液；再分別精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液 0、2、4、8、10、16、20、25 mL 于標(biāo)號(hào) 1～8 的 50 mL容量瓶中，分別加入5%NaNO2溶液1.5 mL，搖勻后靜置6 min，再分別加入10%Al（NO3）3溶液1.5 mL，搖勻靜置6 min，最后加入4%NaOH溶液20 mL，之后再用70%乙醇定容至刻度，搖勻靜置15 min后510 nm下分別測(cè)定吸光值，以蘆丁的質(zhì)量濃度為X軸、吸光度為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：A=0.010 5c-0.002 0，R2=0.999 6。

1.2.3 大孔樹(shù)脂的預(yù)先處理與裝柱

按照所購(gòu)買的樹(shù)脂使用說(shuō)明書(shū)對(duì)大孔樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理，處理后將樹(shù)脂濕法裝柱，裝柱規(guī)格為Φ1.5 cm×30 cm，裝入樹(shù)脂高度為15 cm。

1.2.4 靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)

1.2.4.1 大孔樹(shù)脂型號(hào)篩選試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的4種型號(hào)樹(shù)脂各1 g于具塞錐形瓶，每個(gè)瓶中加入30 mL濃度為0.35 mg/mL的秋葵黃酮樣液，于搖床內(nèi)設(shè)定溫度25℃，轉(zhuǎn)速100 r/min，振蕩12 h使樹(shù)脂吸附飽和，測(cè)定剩余樣液黃酮濃度C1，測(cè)后將吸附飽和的樹(shù)脂過(guò)濾抽干，重置于100 mL錐形瓶中，加入70%乙醇30 mL，于搖床內(nèi)在同樣條件下振蕩12 h，按1.2.2項(xiàng)下方法測(cè)定洗脫液中黃酮濃度Ce，計(jì)算吸附量、吸附率和解析率，每種大孔樹(shù)脂做3個(gè)平行，取其平均值[7-8]。

式中：C0為初始加入的黃酮樣液的濃度，mg/mL；C1為吸附平衡后樣液中黃酮濃度，mg/mL；V1為初始加入的黃酮樣液體積，mL；Ce為加入乙醇洗脫后乙醇中黃酮濃度，mg/mL；V2為加入乙醇體積，mL；M 為干樹(shù)脂的吸附量，g。

1.2.4.2 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

稱取1.0 g預(yù)處理好的最佳吸附型號(hào)的樹(shù)脂于具塞錐形瓶，加入濃度為0.35 mg/mL的秋葵黃酮樣液40 mL，于搖床內(nèi)25℃、100 r/min條件下振蕩，每小時(shí)取0.5 mL溶液測(cè)定黃酮含量，計(jì)算大孔樹(shù)脂吸附量。每種大孔樹(shù)脂做3個(gè)平行，取其平均值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，樹(shù)脂吸附量為縱坐標(biāo)繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

1.2.5 動(dòng)態(tài)吸附-洗脫試驗(yàn)

1.2.5.1 上樣濃度選擇試驗(yàn)

將預(yù)處理過(guò)的AB-8樹(shù)脂濕法裝柱，用3種不同黃酮濃度（0.45、0.60、0.75 mg/mL）的樣液上樣，設(shè)定恒流泵流速0.7 mL/min，自動(dòng)分部收集器每5 min收集一管流出液，測(cè)定每管流出液黃酮濃度，當(dāng)流出液黃酮濃度C與初始黃酮濃度C0幾乎相近時(shí)停止上樣。

1.2.5.2 上樣液流速選擇試驗(yàn)

取濃度為0.55 mg/mL的秋葵黃酮樣液上樣，上樣流速分別設(shè)定0.4、0.7、1.0 mL/min，自動(dòng)分部收集器隔一定時(shí)間收集一管流出液，測(cè)定每管流出液黃酮濃度，當(dāng)流出液黃酮濃度C與初始黃酮濃度C0幾乎相近時(shí)停止上樣。

1.2.5.3 洗脫劑濃度選擇試驗(yàn)

取60 mL濃度為0.6 mg/mL的秋葵黃酮溶液按0.70 mL/min的流速過(guò)柱。過(guò)柱后用100 mL的乙醇洗脫，乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%，流速0.70 mL/min，設(shè)定自動(dòng)分部收集器每5 mL收集一管，跟蹤測(cè)定黃酮濃度，分別測(cè)定每管洗脫液的黃酮濃度，并計(jì)算每管中洗脫出的秋葵黃酮的質(zhì)量，所有管相加即為該乙醇濃度洗脫下的總黃酮質(zhì)量。最后以洗脫液體積為橫坐標(biāo)，以黃酮濃度為縱坐標(biāo)繪制不同乙醇濃度的洗脫曲線。

1.2.5.4 洗脫流速選擇試驗(yàn)

取60 mL濃度為0.6 mg/mL的秋葵黃酮溶液按0.70 mL/min的流速過(guò)柱。過(guò)柱后用100 mL70%乙醇洗脫，洗脫流速分別設(shè)定 0.4、0.7、1.0 mL/min，設(shè)定自動(dòng)分部收集器每5 mL收集一管，跟蹤測(cè)定黃酮濃度，分別測(cè)定每管洗脫液的黃酮濃度，并計(jì)算每管中洗脫出的秋葵黃酮的質(zhì)量，所有管相加即為該流速所洗脫下的總黃酮質(zhì)量。最后以洗脫液體積為橫坐標(biāo)，以黃酮濃度為縱坐標(biāo)繪制不同洗脫流速的洗脫曲線。

1.2.6 秋葵黃酮體外抗氧化活性試驗(yàn)

以上述工藝純化后的秋葵黃酮為原料進(jìn)行體外抗氧化活性試驗(yàn)，還原力的測(cè)定采用鐵氰化鉀還原法[9]；·OH 清除率的測(cè)定采用鄰二氮菲法[10]；O2-·清除率的測(cè)定采用鄰苯三酚自氧化法[10]；DPPH·清除率的測(cè)定采用DPPH法[11]；ABTS+·清除率的測(cè)定采用ABTS 法[6]。

1.2.7 半抑制濃度（half maximal（50%）inhibitory concentration，IC50）的計(jì)算

將黃秋葵黃酮的質(zhì)量濃度對(duì)·OH、DPPH·、ABTS+·、O2-·的清除率作圖并進(jìn)行線性擬合。根據(jù)擬合的線性方程，當(dāng)清除率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)黃秋葵黃酮的質(zhì)量濃度即IC50；以IC50值作為評(píng)價(jià)黃秋葵黃酮的抗氧化能力指標(biāo)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組之間參數(shù)比較采用x2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果分析

2.1 靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)

2.1.1 大孔樹(shù)脂型號(hào)的選擇

4種型號(hào)的樹(shù)脂在相同的靜態(tài)吸附條件下對(duì)秋葵黃酮的靜態(tài)吸附量與解析率見(jiàn)表1。

表1 四種樹(shù)脂的靜態(tài)吸附試驗(yàn)Table 1 The static state absorption experiment of four kinds of resin

由表1可得，4種極性不同的大孔樹(shù)脂，其中弱極性樹(shù)脂AB-8對(duì)黃酮的吸附量最大，但是考率到解析率，則中等極性樹(shù)脂HPD-400最大，因此擬通過(guò)后續(xù)試驗(yàn)綜合考慮選擇兩者之一作為最佳吸附樹(shù)脂。

2.1.2 AB-8和HPD-400樹(shù)脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)研究

AB-8與HPD-400的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線如圖1所示。

從圖1可看出，AB-8樹(shù)脂在靜態(tài)吸附6 h時(shí)就已達(dá)吸附平衡，比HPD-400樹(shù)脂快了2 h，因此，綜合考慮靜態(tài)吸附量與解析率以及樹(shù)脂吸附平衡速率，對(duì)于秋葵黃酮物質(zhì)的吸附，以吸附樹(shù)脂類型為AB-8樹(shù)脂為最佳。

圖1 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 Static adsorption kinetics curves

2.2 動(dòng)態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)

2.2.1 不同濃度上樣液的泄漏曲線

不同上樣濃度的泄漏曲線如圖2所示。

圖2 不同上樣濃度泄露曲線Fig.2 The leaking curve of different sample concentration

從圖2可以看出，上樣液濃度越高，泄露點(diǎn)出現(xiàn)時(shí)間越早，上樣濃度越低，泄露點(diǎn)出現(xiàn)時(shí)間越晚。上樣液濃度0.75 mg/mL時(shí)，泄露點(diǎn)最早出現(xiàn)，因而造成樣品有效成分過(guò)多泄漏，此外，由于上樣濃度過(guò)大，對(duì)樹(shù)脂造成了一定程度堵塞，從而既損失樹(shù)脂又浪費(fèi)樣液。上樣液濃度為0.45 mg/mL時(shí)，泄露點(diǎn)出現(xiàn)最晚，但上樣效率過(guò)低，耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，綜合考慮應(yīng)選擇上樣濃度0.60 mg/mL。

2.2.2 不同上樣流速泄漏曲線

上樣流速對(duì)吸附的影響主要是影響被吸附物質(zhì)向樹(shù)脂內(nèi)部的擴(kuò)散速率，若上樣流速過(guò)快，則樣液中待分離成分還未來(lái)得及與樹(shù)脂充分接觸便已經(jīng)流出吸附柱，從而造成樣液浪費(fèi)；上樣流速慢，則黃酮類物質(zhì)與樹(shù)脂接觸時(shí)間長(zhǎng)，分子能夠充分?jǐn)U散到樹(shù)脂內(nèi)，樹(shù)脂床傳質(zhì)區(qū)間窄，從而可以增大吸附率，但流速過(guò)慢也使上樣時(shí)間過(guò)久。實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)綜合考慮，既要使吸附率增大又需縮短生產(chǎn)時(shí)間提高生產(chǎn)效率。不同上樣流速泄露曲線見(jiàn)圖3。

從圖3可以看出，上樣流速為0.4 mL/min時(shí)耗時(shí)過(guò)久，流速為1.0 mL/min時(shí)泄漏過(guò)早，因此可選擇0.70 mL/min流速作為最佳上樣流速。

圖3 不同上樣流速泄露曲線Fig.3 The leaking curve of different sample flow rate

2.2.3 不同洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的洗脫曲線

由于AB-8樹(shù)脂為弱極性樹(shù)脂，因此選擇極性溶劑洗脫其解析能力強(qiáng)，實(shí)際應(yīng)用中因?yàn)橐掖紵o(wú)毒環(huán)保、價(jià)格低廉易回收，所以多選擇乙醇作為極性樹(shù)脂洗脫劑。而乙醇與水以不同比例混合，其極性發(fā)生變化，可對(duì)樣液有效成分與AB-8樹(shù)脂之間的分子作用力產(chǎn)生影響，且有效成分在不同濃度乙醇中的溶解度也不同，因此要通過(guò)動(dòng)態(tài)洗脫試驗(yàn)進(jìn)行最佳乙醇濃度的篩選，洗脫曲線如圖4所示。

圖4 不同濃度乙醇洗脫曲線Fig.4 The elution curve of different ethanol concentration

由圖4可以看出，洗脫液濃度越高，峰值出現(xiàn)越早，80%乙醇洗脫峰型最寬，所以分離效果不好；70%乙醇洗脫峰型最尖銳，相比50%、60%濃度乙醇其分離效果良好；40%乙醇洗脫峰型出現(xiàn)過(guò)慢且扁平拖尾嚴(yán)重。綜合考慮選擇70%的乙醇濃度進(jìn)行洗脫。

2.2.4 不同洗脫流速洗脫曲線

根據(jù)上一步試驗(yàn)所確定的最佳洗脫劑乙醇濃度，選擇70%乙醇在不同流速下做洗脫曲線，洗脫曲線如圖5。

由圖5也可看出，洗脫流速越慢，峰型越尖銳集中，并且拖尾現(xiàn)象也越不明顯，這是因?yàn)橄疵摿魉僭叫。疵搫┠軌蛟匠浞值剡M(jìn)入樹(shù)脂空隙，被吸附的物質(zhì)越能充分接觸溶劑從而被洗脫下來(lái)。計(jì)算不同流速下洗脫下來(lái)的總黃酮量，流速0.4 mL/min時(shí)，被洗脫的黃酮質(zhì)量為28.32 mg，流速0.7 mL/min時(shí)，被洗脫下的黃酮質(zhì)量為26.46 mg，流速為1.0 mL/min時(shí)，被洗脫下的黃酮質(zhì)量為25.42 mg；因此不管從洗脫出峰尖銳程度還是被洗脫黃酮質(zhì)量來(lái)看，選擇洗脫流速為0.4 mL/min最佳。

圖5 不同流速洗脫曲線Fig.5 The elution curve of different flow rate

2.2.5 AB-8大孔樹(shù)脂純化秋葵黃酮最佳動(dòng)態(tài)吸附-洗脫條件驗(yàn)證

根據(jù)前面試驗(yàn)結(jié)果，取60mL濃度為0.60 mg/mL的秋葵黃酮樣液按0.70 mL/min的流速上樣，再用100 mL 70%乙醇以0.40 mL/min的流速洗脫，收集全部洗脫液，揮去一部分溶劑后將剩余洗脫液轉(zhuǎn)移到一個(gè)干燥并稱重過(guò)的培養(yǎng)皿中，將其冷凍干燥，干燥后立刻稱重，差量法計(jì)算洗脫物質(zhì)質(zhì)量后再用100 mL70%乙醇復(fù)溶，測(cè)定其中黃酮含量，得到純化后黃酮純度達(dá)到67.3%，比純化前高出28.1%。

2.3 秋葵黃酮的體外抗氧化性活性

秋葵黃酮的還原力及·OH、O2-·、DPPH·、ABTS+·清除率見(jiàn)圖6。

圖6 秋葵黃酮的還原力及·OH、O2-·、DPPH·、ABTS+·自由基清除率Fig.6 Reducing power and hydroxyl，superoxide anion，DPPH and ABTS+radical scavenging activities of okra flavonoids

由圖6可以看出，在所考查的秋葵黃酮濃度范圍內(nèi)，秋葵黃酮與VC溶液的還原能力都隨濃度增加而增強(qiáng)，且秋葵黃酮提取液的還原能力要優(yōu)于VC溶液。秋葵黃酮對(duì)·OH、O2-·、DPPH·、ABTS+·均具有一定的清除能力，且清除能力隨秋葵黃酮濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)秋葵黃酮濃度為1.0 mg/mL時(shí)，其最大清除率分別為90.4%、80.4%、77.6%、88.4%，具有良好的體外抗氧化活性。對(duì)秋葵黃酮的·OH、O2-·、DPPH·、ABTS+·清除率與濃度進(jìn)行線性擬合，其線性擬合方程分別為：Y（·OH）=115.76X-15.227，R2=0.9557；Y（O2-·）=61.83X+23.873，R2=0.975 1；Y（DPPH·）=70.624X+6.087，R2=0.980 6；Y（ABTS+·）=80.364X+8.06，R2=0.992 7，均表現(xiàn)出良好的線性量效關(guān)系，從而可計(jì)算出秋葵黃酮的·OH、O2-·、DPPH·、ABTS+·的 IC50值分別為 0.56、0.42、0.62、0.52 mg/mL。同理可得 VC的·OH、O2-·、DPPH·、ABTS+·的 IC50值分別為 0.46、0.34、0.27、0.35 mg/mL，由此可知秋葵黃酮的抗氧化能力僅比VC略低，有很好的開(kāi)發(fā)前景。

3 結(jié)論

通過(guò)大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)以及動(dòng)態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)對(duì)秋葵黃酮吸附分離的研究可知，AB-8型大孔樹(shù)脂可作為純化秋葵黃酮類物質(zhì)的最佳吸附樹(shù)脂，其純化秋葵黃酮的最佳工藝為上樣液濃度0.60 mg/mL，上樣液流速0.70 mL/min，洗脫劑乙醇濃度為70%，洗脫流速為0.40 mL/min。最佳工藝純化秋葵黃酮可使提取物黃酮純度由39.2%提高到67.3%，說(shuō)明AB-8樹(shù)脂對(duì)秋葵黃酮具有良好的純化效果且該純化工藝可行。純化后的秋葵黃酮的總還原力高于VC，對(duì)·OH、O2-·、DPPH·、ABTS+·的IC50值分別為0.56、0.42、0.62、0.52，且濃度為1.0 mg/mL時(shí)，其最大清除率分別為90.4%、80.4%、77.6%、88.4%，具有良好的體外抗氧化活性。