皮明山，茹琴，龔曉康，田香，黎炎梅，唐利軍，*，李超英，4，*

（1.江漢大學(xué)武漢生物醫(yī)學(xué)研究院，湖北武漢430056；2.湖北省應(yīng)用毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430079；3.湖北省疾病預(yù)防控制中心，湖北武漢430079；4.漢濟(jì)生物科技（武漢）有限公司，湖北武漢430079）

中風(fēng)是人類健康最嚴(yán)重的威脅之一。全球每年有超過200萬的新發(fā)卒中病例和150萬卒中相關(guān)死亡病例。缺血性中風(fēng)占所有中風(fēng)病例的87%，是導(dǎo)致其死亡和后遺癥的主要原因[1]。雖然溶栓治療是治療缺血性中風(fēng)的一種有效方法，但這種治療通常會(huì)導(dǎo)致更為嚴(yán)重的腦功能障礙，稱為腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia and reperfusion injury，CIRI），這是由復(fù)雜的機(jī)制引起的[2]。

凋亡是細(xì)胞為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭(zhēng)取的一種細(xì)胞死亡過程，發(fā)生在許多重要的生理?xiàng)l件下，如胚胎發(fā)育和組織重塑[3]。許多疾病與不同程度的細(xì)胞凋亡有關(guān)，包括癌癥，自身免疫，敗血癥和神經(jīng)退行性疾病[4]。已有的研究已經(jīng)證明凋亡在CIRI中也起著重要作用[5]。胱天蛋白酶-3（Caspase-3）是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用[6]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxiainducible factor，HIF-1α）是調(diào)節(jié)多種凋亡調(diào)控基因的重要核轉(zhuǎn)錄因子，包括可促進(jìn)缺血缺氧后的血管重建和神經(jīng)功能改善的促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）[7]。最近的研究表明，HIF-1α-EPO信號(hào)通路的激活在CIRI誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[8]。

人參是中國傳統(tǒng)的藥食兩用資源，已有3 000多年的歷史，因其預(yù)防及治療疾病的功效在亞洲越來越受歡迎[9-10]。許多研究表明人參中主要的生物活性成分是人參皂苷，它是人參大部分藥理作用的主要有效成分，包括抗凋亡、抗癌和抗氧化活性[11-12]。此外，有研究表明，幾類人參皂苷在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元或體外神經(jīng)元模型中顯示出抗凋亡作用。例如，人參皂苷Rg1在PC12細(xì)胞中可以保護(hù)β淀粉樣蛋白（Aβ）誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性；人參皂苷Rb1在體外對(duì)CIRI具有保護(hù)作用[13-14]。

人參皂苷 Rg2（ginsenoside-Rg2，Rg2）也是人參皂苷中的一種，能夠改善動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)和記憶能力[15]，并且Rg2對(duì)心肌缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡也具有良好的保護(hù)作用[16]。值得注意的是，在我們以前的研究中已經(jīng)顯示了Rg2對(duì)氧糖剝離/再灌注 （oxygenglucose deprivation/reperfusion，OGD/R）誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，并且我們推測(cè)這種保護(hù)作用可能與抗凋亡相關(guān)[17]。另外，Rg2包含兩個(gè)立體異構(gòu)體[20（R）-Rg2 和 20（S）-Rg2]，由于其碳-20 上的羥基空間結(jié)構(gòu)不同[18]。結(jié)構(gòu)上的差異通常會(huì)導(dǎo)致作用效果的不同，例如，20（R）-Rg3的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能比 20（S）-Rg3 更有效[19]。然而，Rg2 對(duì) CIRI誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響是否也具有立體異構(gòu)性還未見報(bào)道。

因此，我們使用大腦皮層神經(jīng)元建立OGD/R的細(xì)胞模型，該模型常用于體外模擬CIRI[20]。來探討Rg2的立體異構(gòu)體[20（R）-Rg2 和 20（S）-Rg2]對(duì) OGD/R誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元凋亡的影響及可能的調(diào)控機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

1日齡SD大鼠，SPF級(jí)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK-（京）-2016-0006。

1.2 試劑與儀器

20（R）-Rg2、20（S）-Rg2 ：成都曼思特生物科技有限公司；高糖改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco modified eagle medium，DMEM）、Neuronbasal培養(yǎng)基、2%B-27 Supplement 50×、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶：GIBCO，美國；無糖DMEM：杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；多聚賴氨酸、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽 [3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]、三氯化氫 2-（4-乙基苯基）-5-（4-甲基-1-哌嗪基）-2，5-二-1H-苯并咪唑 [2-（4-Ethoxyphenyl）-5-（4-methyl-1-piperazinyl]-2，5-bi-1H-benzimidazole，trihydrochloride，Hoechst 33342）、碘化丙啶 （propidium iodide，PI）：Sigma，美國；Fluo-3AM ：Dojindo，日本；Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)研究所；HIF-1α和EPO酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒：上海酶聯(lián)生物科技有限公司；

Eppen-dor 5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：Eppendorfg Inc，德國；Multiskan FC型酶標(biāo)儀、CO2培養(yǎng)箱：Sigma，美國；Olympus IX71 型熒光顯微鏡：Pooher，日本；BS224S型電子分析天平：Sartorius AG，德國。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

按照參考文獻(xiàn)[21]的細(xì)胞培養(yǎng)方法，取新生1日齡的SD大鼠，無菌條件下剝離軟腦膜后，分離大腦皮質(zhì)，剪碎腦組織，加入0.125%胰蛋白酶，于37℃、5%CO2孵箱中消化15 min后，加入DMEM稀釋終濃度為10%胎牛血清終止消化，200目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，1 000 r/min離心8 min。棄上清，加入含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)液（種植培養(yǎng)液），吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL。以每瓶2 mL接種于多聚賴氨酸包被的25 cm2培養(yǎng)瓶，用于檢測(cè)Caspase-3的活性；以每孔800 μL接種于6孔板，用于檢測(cè)HIF-1α和EPO的含量；以每孔200 μL接種于24孔板，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡；每孔50 μL接種于96孔板，用于檢測(cè)細(xì)胞存活率。于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24小時(shí)后全部換成含2%B27添加劑、1%谷氨酰胺的Neuronbasal培養(yǎng)液（維持培養(yǎng)液），以后每2天半量換液1次，培養(yǎng)至7 d～10 d用于試驗(yàn)。

1.3.2 分組及模型制備

將培養(yǎng)7 d的皮層神經(jīng)元分成4組：對(duì)照組、模型組、20（R）-Rg2 組和 20（S）-Rg2 組。20（R）-Rg2 組及20（S）-Rg2 組分別加入濃度為 20、40、80 μmol/L 的20（R）-Rg2和 20（S）-Rg2預(yù)先處理 24 h。隨后模型組、20（R）-Rg2組及 20（S）-Rg2組按照參考文獻(xiàn)[20]方法造模：各組棄去培養(yǎng)液，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌 2次，加入 95%N2和5%CO2預(yù)飽和的無糖DMEM培養(yǎng)液模擬細(xì)胞缺血缺氧狀態(tài)，置于37℃低氧環(huán)境下培養(yǎng)2小時(shí)后換成正常的維持培養(yǎng)液在常規(guī)的37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以形成再灌注，OGD/R模型制備完成；對(duì)照組不給藥也不經(jīng)過OGD/R處理。

1.3.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

細(xì)胞再灌注24 h時(shí)，取出各96孔板，每組每孔均加入20 μL 5 g/L的MTT溶液，繼續(xù)置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。4小時(shí)后，將各組的培養(yǎng)液吸棄，每孔各加入150 μL DMSO，振蕩混勻10 min，在570 nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度（OD）值，然后設(shè)對(duì)照組的吸光度值為100%存活率，計(jì)算出其他各組相對(duì)于對(duì)照組的相對(duì)存活率。

1.3.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

使用Hoechst/PI核染色進(jìn)行細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)評(píng)估。如文獻(xiàn)所述[22]，簡(jiǎn)言之，再灌注24 h時(shí)取出各24孔板，用PBS洗滌2次，然后向每孔中加入20 μL Hoechst33342（10 μg/mL）。緊接著在37℃避光染色20 min 后，將 15 μL PI（15 μg/mL）加入到每個(gè)孔中，25℃避光染色15 min。最后，在熒光顯微鏡下分別用紫外和綠光激發(fā)熒光并觀察。每個(gè)孔在同一視野下，并使用紫外和綠光相同的曝光時(shí)間，將這兩個(gè)圖像重疊以識(shí)別細(xì)胞凋亡和壞死（原始放大倍數(shù)，×200）。使用Image J軟件（原始放大倍數(shù)，×100）計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率通過下式計(jì)算：細(xì)胞凋亡率/%=凋亡細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100。

1.3.5 Caspase-3活性檢測(cè)

按試劑盒說明，以戍糖核酸（pentose nucleic acid，pNA）為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；取出培養(yǎng)瓶，吸取培養(yǎng)液備用，用胰酶消化神經(jīng)元，收集至備用培養(yǎng)液中，在4℃下1 000 r/min離心8 min，小心吸除上清，PBS洗滌1次，吸取上清后按每200萬細(xì)胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min，在4℃下10 000 r/min離心10 min后將上清轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中作為樣品，取少量樣品用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整濃度為1 mg/mL～3 mg/mL；設(shè)置 100 μL 反應(yīng)體系（檢測(cè)緩沖液 50 μL，待測(cè)樣品 40 μL，熒光底物 Ac-DEVD-pNA 10 μL），加到96孔板，混勻，37℃孵育過夜；在405 nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值，然后將OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)pNA的濃度，再根據(jù)Caspase-3酶活力單位的定義計(jì)算出相應(yīng)Caspase-3的活性。

1.3.6 HIF-1α和EPO表達(dá)水平的測(cè)定

為了量化HIF-1α和EPO的量，進(jìn)行ELISA測(cè)定。再灌注24 h時(shí)，收集細(xì)胞后制備細(xì)胞裂解液，用相應(yīng)的ELISA試劑盒按照說明書進(jìn)行測(cè)定HIF-1α和EPO的蛋白表達(dá)水平。使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定各樣品OD值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 20（R）-Rg2和20（S）-Rg2對(duì)神經(jīng)元活力的影響各組細(xì)胞存活率的比較見表1。

表1 各組細(xì)胞存活率的比較（±s）Table 1 Comparison of cell survival rates in each group（±s）

表1 各組細(xì)胞存活率的比較（±s）Table 1 Comparison of cell survival rates in each group（±s）

注：*P＜0.05表示與對(duì)照組比較差異有顯著性；△P＜0.05表示與模型組比較差異有顯著性；▲P＜0.05表示與20（S）-Rg2組同濃度比較差異有顯著性。

組別濃度/（μmol/L）n相對(duì)存活率/%對(duì)照 6 100.0±3.6模型 6 55.6±2.4*20（R）-Rg2 20 6 77.3±2.2△▲40 6 86.1±2.5△▲80 6 96.8±1.6△▲20（S）-Rg2 20 6 69.6±2.3△40 6 78.3±2.4△80 6 90.1±2.5△

如表1所示，與對(duì)照組相比，OGD/R模型組細(xì)胞活力顯著下降（P＜0.05）；與模型組比較，不同濃度20（R）-Rg2 和 20（S）-Rg2（20、40、80 μmol/L）預(yù)處理組細(xì)胞活力均顯著增加（P＜0.05）。此外，在所有測(cè)試劑量下20（R）-Rg2預(yù)處理組的細(xì)胞存活率均高于20（S）-Rg2預(yù)處理組（P＜0.05）。

有文獻(xiàn)報(bào)道，OGD/R通常會(huì)降低神經(jīng)元的活力[23]。試驗(yàn)結(jié)果說明20（R）-Rg2和20（S）-Rg2均能減弱了OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元活力的受損程度。此外，天然物質(zhì)的立體異構(gòu)性受到越來越多的研究者關(guān)注。例如，左旋四氫巴馬汀具有鎮(zhèn)痛作用，而其右旋異構(gòu)體不具有；20（R）-人參皂苷Rh2能抑制破骨細(xì)胞形成，而20（S）-人參皂甙Rh2不能[24-25]。在研究中，體外比較20（R）-Rg2和20（S）-Rg2的神經(jīng)保護(hù)作用。發(fā)現(xiàn)20（R）-Rg2顯示出比20（S）-Rg2更強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用。

2.2 20（R）-Rg2和20（S）-Rg2對(duì)神經(jīng)元凋亡的影響

20（R）-Rg2和 20（S）-Rg2對(duì) OGD/R 誘導(dǎo)的大鼠皮層神經(jīng)元凋亡的影響見圖1。

如圖1A所示，與對(duì)照組比較，可以觀察到模型組凋亡細(xì)胞明顯增加；與模型組相比，20（R）-Rg2和20（S）-Rg2（20、40、80 μmol/L）預(yù)處理組中凋亡細(xì)胞均明顯減少。由圖1B可知，20（R）-Rg2和20（S）-Rg2（20、40、80 μmol/L）預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率與模型組相比均明顯降低（P＜0.05）；然而，20（R）-Rg2（40 μmol/L和80 μmol/L）預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率均低于 20（S）-Rg2（40 μmol/L 和 80 μmol/L）預(yù)處理組（P＜0.05）。

圖1 20（R）-Rg2和20（S）-Rg2對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的大鼠皮層神經(jīng)元凋亡的影響Fig.1 Effects of 20（R）-Rg2 and 20（S）-Rg2 on apoptosis of rat cortical neurons induced by OGD/R

在許多研究中，使用OGD/R細(xì)胞模型來模擬CIRI，通常能誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞的凋亡[20，21，26]。該試驗(yàn)結(jié)果也說明了皮層神經(jīng)元在OGD/R后可觀察到明顯的細(xì)胞凋亡，然而，用 20（R）-Rg2 和 20（S）-Rg2（20，40和80 μmol/L）預(yù)處理均可明顯抑制OGD/R所誘導(dǎo)的凋亡增加。此外，20（R）-Rg2（40 μmol/L 和 80 μmol/L）比 20（S）-Rg2（40 μmol/L 和 80 μmol/L）更有效地抑制細(xì)胞凋亡。

2.3 20（R）-Rg2和 20（S）-Rg2對(duì) Caspase-3活性的影響

各組Caspase-3活性的比較見表2。從表2可以看出，模型組Caspase-3的活性與對(duì)照組相比明顯增加（P＜0.05）；與模型組相比，20（R）-Rg2 和 20（S）-Rg2（20，40和 80 μmol/L）預(yù)處理組的 Caspase-3活性均明顯降低。然而，20 （R）-Rg2 （80 μmol/L） 預(yù)處理組Caspase-3活性顯著低于 20（S）-Rg2（80 μmol/L）預(yù)處理組（P＜0.05）。

Caspase-3是一種經(jīng)常活化的死亡蛋白酶，對(duì)OGD/R引起的細(xì)胞凋亡很重要[27]。該試驗(yàn)結(jié)果說明，所有測(cè)試劑量的20（R）-Rg2和20（S）-Rg2均能有效抑制OGD/R所誘導(dǎo)的Caspase-3活性增加，并且20（R）-Rg2（80 μmol/L）比 20（S）-Rg2（80 μmol/L）能更有效地抑制OGD/R所誘導(dǎo)的Caspase-3活性增加。

2.4 20（R）-Rg2和 20（S）-Rg2對(duì) HIF-1α 和 EPO 表達(dá)的影響

各組HIF-1α和EPO含量的比較見表2。

表2 各組Caspase-3活性、HIF-1α和EPO含量的比較（±s）Table 2 Comparison of caspase-3 activity，HIF-1α and EPO content in each group（±s）

表2 各組Caspase-3活性、HIF-1α和EPO含量的比較（±s）Table 2 Comparison of caspase-3 activity，HIF-1α and EPO content in each group（±s）

注：*P＜0.05表示與對(duì)照組比較差異有顯著性；△P＜0.05表示與模型組比較差異有顯著性；▲P＜0.05表示與20（S）-Rg2組同濃度比較差異有顯著性。

組別濃度/（μmol/L）nCaspase-3活性/（U/mgprot）HIF-1α含量/（ng/gprot）EPO含量/（IU/gprot）對(duì)照 6 63.0±7.4 12.0±1.2 14.7±0.1模型 6 231.6±25.0* 17.0±1.6* 19.5±0.1*20（R）-Rg2 20 6 195.8±10.0△ 18.7±2.4 19.6±1.3 40 6 173.8±18.6△ 26.2±1.0△▲ 20.5±0.2△80 6 140.4±10.2△▲ 33.2±0.9△▲ 23.1±0.1△▲20（S）-Rg2 20 6 196.9±16.6△ 17.7±2.2 19.5±1.2 40 6 180.1±17.8△ 22.1±1.3△ 20.2±0.1△80 6 161.2±10.6△ 29.3±0.8△ 21.9±0.2△

由表2可知，與模型組相比，20（R）-Rg2和20（S）-Rg2（40 μmol/L 和 80 μmol/L）預(yù)處理組中 HIF-1α和EPO的表達(dá)水平均顯著增加（P＜0.05）。然而，20（R）-Rg2 （40 μmol/L 和 80 μmol/L） 預(yù)處理組的HIF-1α 表達(dá)水平顯著高于 20（S）-Rg2（40 μmol/L 和80 μmol/L）預(yù)處理組（P＜0.05）；20（R）-Rg2（80 μmol/L）預(yù)處理組的 EPO 表達(dá)水平高于 20（S）-Rg2（80 μmol/L）預(yù)處理組（P＜0.05）。

HIF-1α與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，調(diào)節(jié)多種凋亡調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。此外，許多研究報(bào)道HIF-1α在EPO的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用[7，28]。最近的研究也表明HIF-1α-EPO信號(hào)通路的激活在CIRI誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起重要作用[8]。該試驗(yàn)結(jié)果表明，用20（R）-Rg2和 20（S）-Rg2（40 μmol/L 和 80 μmol/L）預(yù)處理后，均能明顯地激活HIF-1α-EPO信號(hào)傳導(dǎo)通路；并且20（R）-Rg2（80 μmol/L）比 20（S）-Rg2（80 μmol/L）能更有效地激活HIF-1α-EPO信號(hào)通路。在實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)模型組中HIF-1α和EPO的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，從表2中可以看出。因此，繪制了OGD/R誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元中HIF-1α和EPO的表達(dá)量隨時(shí)間的變化曲線，如圖2所示。發(fā)現(xiàn)皮層神經(jīng)元OGD/R 24小時(shí)后HIF-1α和EPO的表達(dá)水平確實(shí)高于正常組，這也與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[29]。

圖2 HIF-1α（A）和EPO（B）隨時(shí)間變化曲線Fig.2 Curves of HIF-1α（A）and EPO（B）over time

3 結(jié)論

20（R）-Rg2和 20（S）-Rg2均能通過有效地抑制由OGD/R所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡而對(duì)皮層神經(jīng)元起到預(yù)防保護(hù)作用。這種保護(hù)作用機(jī)制可能與20（R）-Rg2和20（S）-Rg2下調(diào)caspase-3的活性以及激活HIF-1α-EPO信號(hào)通路有關(guān)。20（R）-Rg2比20（S）-Rg2能更有效地抑制OGD/R所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。因此20（R）-Rg2有潛力被用作預(yù)防CIRI的功能性食品中的有效成分之一。然而，還需要更多的體內(nèi)甚至臨床研究，來進(jìn)一步評(píng)估20（R）-Rg2預(yù)防和治療相關(guān)疾病的作用。