葉秀娟 黃穎賢 李少鳳

川牛膝為莧科植物川牛膝Cyathula officinalis Kuan的干燥根[1-3]，其性平，味甘、微苦，歸肝、腎經(jīng)，具有逐瘀通經(jīng)、通利關(guān)節(jié)、利尿通淋的功效，主要分布于四川、貴州、云南等地區(qū)。川牛膝含有的水溶性物質(zhì)——多糖[4-5]為活性物質(zhì)，其具有增強(qiáng)免疫力，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、保護(hù)肝臟、升高白細(xì)胞的功能，常用于免疫調(diào)節(jié)和腫瘤治療等，因此對川牛膝多糖的研究有較高的應(yīng)用價值。研究川牛膝多糖首先需要將多糖最大限度的提取出來，近年來對川牛膝多糖的常規(guī)提取研究主要集中在水煮法、超聲法等，已有的常規(guī)方法具有損失大、工序多、周期長、提取率低等缺點，因此迫切需要開發(fā)新的提取方法為工業(yè)大規(guī)模提取多糖提供技術(shù)上的支持。酶在適當(dāng)?shù)臈l件下具有一定的活性，尤其是纖維素酶對植物細(xì)胞壁有很好的作用。本研究旨在用正交試驗復(fù)合酶法[6]優(yōu)化川牛膝多糖的提取工藝，為工業(yè)大規(guī)模提取提供技術(shù)支持和后期研究川牛膝多糖奠定理論基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 材料、儀器與試驗材料

川牛膝（安徽亳州生產(chǎn)，批號：20170920）；中草藥粉碎機(jī)（許昌市豫邦機(jī)械制造有限公司生產(chǎn)，型號：ZY-C350）；紫外分光光度計（濟(jì)南思泉醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)，型號：TU-1810）；恒溫磁力攪拌器[珩衍謹(jǐn)誠（北京）科技有限公司生產(chǎn)，型號：85-2]；高速離心機(jī)（賽默飛生產(chǎn)，型號：賽Sorvall LYNX4000）；電子天平（賽多利斯生產(chǎn)，型號：BSA224S）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海越眾儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)，型號：R201D）；pH計（賽多利斯生產(chǎn)，型號：PB-21）；蒸餾水（屈臣氏生產(chǎn)）；葡萄糖（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，分析純）；苯酚、濃硫酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，分析純）；乙醇（OMNI生產(chǎn)，分析純）；纖維素酶（酶活力≥400 U/mg，批號：20171213）、蛋白酶（酶活力≥100 U/mg，批號：20180324）、果膠酶（酶活力≥500 U/mg，大連美倫生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號：20171120）。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖提取流程取干燥的川牛膝→粉碎→篩分→稱取→提取→調(diào)節(jié) pH值→復(fù)合酶提取→滅酶→抽濾→減壓濃縮→醇沉過夜→離心分離→沉淀復(fù)溶→粗多糖溶液。

2.2 操作要點將川牛膝用粉碎機(jī)粉碎后過 80目篩，備用。稱取約10 g川牛膝粉末，按料液比加入蒸餾水，提??；提取后加入緩沖液并用酸度計調(diào)節(jié)pH值，按纖維素酶:果膠酶:蛋白酶=1:1:1加入一定質(zhì)量的復(fù)合酶，于恒溫磁力攪拌器上恒溫提取60 min后，90℃滅酶 10 min；真空抽濾機(jī)抽濾，取濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至30～50 ml，向濃縮液中加入3倍體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，4℃條件下醇沉過夜；4000 r/min離心15 min后收集沉淀，加入蒸餾水復(fù)溶，即得出多糖溶液。

2.3 川牛膝多糖含量測定

2.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精密稱取葡萄糖對照品20.00 mg至100 ml容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋定容至刻度，搖勻后即得濃度為0.2 mg/ml的葡萄糖對照品儲備液。分別量取對照品儲備液1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0 ml、6.0 ml、7.0 ml置于 50 ml容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，備用。按照苯酚-硫酸法顯色，在490 nm下紫外掃描測定吸光度，記錄葡萄糖濃度（X）相應(yīng)的吸光度（Y），并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=11.125X+0.0281（r=1.000）,在0.008～0.056 mg/ml濃度范圍內(nèi)線性良好（圖1）。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3.2 含量測定取川牛膝多糖溶液適量，于50 ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋，定容至刻度，搖勻。按照苯酚-硫酸法顯色，在490 nm下紫外掃描測定吸光度，帶入2.3.1項下的線性方程計算濃度，進(jìn)而推算多糖含量。計算公式：多糖得率=nCV0/（100 m）×100%。針對公式特殊說明：C為提取的川牛膝多糖樣品液的質(zhì)量濃度（mg/ml）；n為稀釋倍數(shù)；V0為川牛膝多糖樣品液的總體積（ml）；m為稱取的預(yù)處理的川牛膝粉的質(zhì)量（g）。

2.4 正交試驗

2.4.1 優(yōu)化川牛膝多糖提取工藝在預(yù)實驗單因素考察的基礎(chǔ)上，用正交試驗對復(fù)合酶法提取川牛膝多糖進(jìn)行優(yōu)化，選取料液比（g/ml）、復(fù)合酶（纖維素酶:果膠酶:蛋白酶=1:1:1）用量（%）、pH 值、溫度（℃）4個對結(jié)果影響較大的因素，在3水平上用多糖含量作為評價指標(biāo)設(shè)計正交試驗L9（34），因素水平設(shè)計如表1。

表1 正交試驗主要因素與水平表

表2 復(fù)合酶法優(yōu)化川牛膝多糖提取工藝正交試驗結(jié)果

由表2結(jié)果直觀分析可得，以多糖含量為考察指標(biāo)，四個因素影響程度依次為 C＞B＞D＞A，且A1＞A2＞A3、B2＞B3＞B1、C3＞C2＞C1、D2＞D1＞D3可以得出，最佳工藝條件為A1B2C3D2。

表3 復(fù)合酶法優(yōu)化川牛膝多糖提取工藝方差分析表

由表3方差分析可得，以多糖含量為考察指標(biāo)時，因素C對試驗結(jié)果有顯著性影響，因素A、B和D對實驗結(jié)果均無顯著性影響，因此最佳制備工藝為A1B2C3D2，即料液比為 1:20（g/ml）、復(fù)合酶用量為0.7%、pH值為6.0、溫度為45℃為最佳工藝條件。

2.4.2 驗證性試驗通過正交試驗確定最佳制備工藝條件，并進(jìn)行驗證實驗。按照計算出的多糖含量計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來分析最佳公工藝條件是否穩(wěn)定。平行制備6份，結(jié)果見表6。

表4 驗證試驗結(jié)果

結(jié)果顯示，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.09%，得出復(fù)合酶法優(yōu)化川牛膝多糖提取方案的重現(xiàn)性較好，說明最佳提取工藝條件穩(wěn)定可行。

3 討論

通過正交試驗[7-9]對復(fù)合酶法提取川牛膝多糖工藝進(jìn)行篩選，得出最佳的提取方案為料液比為1:20（g/ml）、復(fù)合酶用量為0.7%、pH值為6.0、溫度為 45℃。在最佳方案的基礎(chǔ)上對該方法進(jìn)行驗證性試驗，驗證結(jié)果具有較好的重現(xiàn)性，該方法可行，可用于川牛膝多糖工業(yè)上的大規(guī)模提取。在確定葡萄糖測定的最大紫外吸收波長時，筆者從配制一定濃度的對照品溶液顯色后在190～800 nm進(jìn)行波長掃描，發(fā)現(xiàn)在490 nm處有較大的吸收，故確定490 nm為最大紫外吸收波長。本研究采用的復(fù)合酶可以將細(xì)胞壁溶解，能最大限度地增加多糖得率。酶[10]的活性容易受到溫度、pH值等因素的影響，故將溫度、pH值[11]作為正交試驗的因素。預(yù)實驗過程中先將其余 3個因素固定，只改變剩余的一個因素，考察這一因素在不同條件下的多糖得率，得出最佳的結(jié)果，其他單因素考察以此類推。

近年來，對于復(fù)合酶法提取藥材中多糖的研究屢見不鮮，比如復(fù)合酶法提取白術(shù)多糖、枸杞多糖、海帶多糖[12-14]等，可見復(fù)合酶法應(yīng)用廣泛。本研究也進(jìn)一步證明復(fù)合酶法提取多糖可靠，易行。筆者研究復(fù)合酶法優(yōu)化川牛膝多糖的最佳提取工藝為后續(xù)研究多糖活性奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。