林文津 郭舜民 徐小妹 徐榕青 張亞敏 李麗莎 盧雪花

根據(jù)第二次全國殘疾人抽樣調(diào)查結(jié)果，2006年福建省殘聯(lián)統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析報告顯示，福建省各類殘疾人總數(shù)為221.1萬人，占總?cè)丝诘?.25%，其中聽力殘疾61.3萬人，占27.73%，是目前福建省殘疾人人數(shù)及比重最多的人群。目前聽力殘疾尚無特效治療方法，但遺傳性耳聾基因檢測可為部分耳聾患者找到病因。目前基因檢測的方法有多種，包括毛細(xì)管電泳測序法[1]、基因芯片法[2]、熒光定量PCR法[1]、高通量測序法[3]、飛行時間質(zhì)譜法[4]等。本研究采用飛行時間質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)的毛細(xì)管電泳測序技術(shù)，對福建省福州、龍巖、南平、三明地區(qū)部分非綜合征型聾患者的GJB2、SLC26A4、12SrRNA、GJB3 4個基因共20個常見突變位點進行檢測，以探討福建省聾病患者常見突變基因及突變熱點，為福建省開展聾病患者優(yōu)生優(yōu)育及個體化用藥的遺傳咨詢、基因診斷和預(yù)防干預(yù)提供參考。

1 資料與方法

1.1研究對象 2014年12月～2017年12月在福建省福州(190例，男92，女68)、龍巖(134例，男77，女57)、南平(132例，男67，女65)、三明市(150例，男76，女74)聾啞學(xué)校收集非綜合征型聾患者606例，其中籍貫為福州的130例，龍巖148例，三明150例，南平134例，寧德18例，泉州13例，莆田8例，漳州3例，廈門2例；漢族594例，畬族6例，滿族3例，土家族2例，苗族1例；年齡1～55歲，聽力損失程度為輕度105例，中度81例，重度246例，極重度174例；語前聾362例，語后聾244例。本研究經(jīng)福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意認(rèn)可，研究資料及臨床標(biāo)本的采集均獲得了患者本人及家屬的知情同意，簽署了知情同意書，并填寫了患者基本信息登記表以便詳細(xì)了解患者病史。

1.2研究方法

1.2.1儀器與試劑 Mass ARRAY DNA質(zhì)譜陣列基因分析系統(tǒng)(美國 Sequenom 公司)、QIAcube核酸純化儀(QIAGEN公司)、超微量蛋白核酸分析儀(英國Biodrop公司)、PCR儀(Bio-Rad 公司)、ABI3730 測序儀、QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN公司)，Taq PCR Mastermix(天根公司)，引物序列采用Sequenom 公司提供的軟件Mass ARRAY Assay Design參考文獻設(shè)計，引物合成由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司完成。

1.2.2全血基因組DNA的提取 采集所有受檢者的外周靜脈血約2 ml，EDTA抗凝，參照QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒的使用說明書進行，提取得受檢者全血基因組DNA100 μl，應(yīng)用超微量分光光度計檢測提取得到的患者基因組DNA濃度與純度，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組完整性，凍存在-80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.2.3PCR擴增 取試劑盒中擴增反應(yīng)液mix 12.5 μl，加入擴增引物各1 μl，DNA模板加入2 μl，最后加水至25 μl，然后上機進行PCR擴增。溫度循環(huán)程序為： 94 ℃、5 min，1個循環(huán)； 94 ℃、45 s，55 ℃～60 ℃、1 min，72 ℃、45 s，30個循環(huán)； 72 ℃、5 min，1個循環(huán)。

1.2.4耳聾基因突變檢測 飛行時間質(zhì)譜檢測：將上述擴增產(chǎn)物經(jīng)蝦堿式磷酸酶消化、延伸引物單堿基延伸、陽離子消化樹脂純化后用質(zhì)譜儀按照儀器操作說明書進行。檢測的基因及位點：12SrRNA基因1555A→G、1494C→T，GJB2基因35del G、167del T、176_191del 16、235del C、299_300del AT，SLC26A4基因281C→T、589G→A、IVS7-2 A→G、1174A→T、1226G→A、1229C→T、IVS15+5 G→A、1975GC、2027T→A、2162C→T、2168A→G，GJB3基因538C→T、547G→A。

毛細(xì)管電泳測序驗證：參考文獻采用的常規(guī)方法[5]制備成測序模板后，用傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳測序法在ABI3730 測序儀上對GJB2編碼區(qū)序列和SLC26A4 21個外顯子序列測序驗證。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，不同地區(qū)非綜合征型聾患者組間基因突變檢出數(shù)兩兩比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

606例非綜合征型聾患者中共檢測出耳聾基因突變140例(23.10%，140/606)，其中12SrRNA 基因突變40例(6.60%,40/606，主要集中在3個家系)，GJB2耳聾基因突變67例(11.06%,67/606)，SLC26A4突變患者33例(5.54%,33/606)，未檢出GJB3基因突變。毛細(xì)管電泳測序驗證了飛行時間質(zhì)譜檢測結(jié)果，但測序也發(fā)現(xiàn)了一些較不常見的突變位點，如GJB2基因511_512insAACG(4例)，257C→G(1例)，SLC26A4 基因754T→C(2例)、Exon1_Exon3Del(2例)、1686_1687insA(1例)、1079C→T (1例)、1707+5G→A(1例)、1646insA(1例)突變，這些位點純合突變或復(fù)合雜合突變也會致聾。606例非綜合征型聾患者基因檢測結(jié)果見表1、2，可見，除南平地區(qū)基因突變檢出率高于福州地區(qū)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)外，其他地區(qū)間檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 福建不同地區(qū)非綜合征型聾患者12SrRNA、GJB2、SLC26A4基因突變檢出例數(shù)及檢出率(例)

表2 140例非綜合征型聾患者基因突變位點、突變類型及檢出例數(shù)(例)

注：*該突變不屬于20個常見突變位點，采用傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳測序法檢出。

3 討論

本研究通過對福建省福州市、龍巖市、南平市、三明市四個地區(qū)非綜合征型聾患者四個常見耳聾基因12SrRNA、GJB2、SLC26A4、GJB3基因20個常見突變位點檢測分析，可以為23.10%的患者找到耳聾分子病因，略低于文獻[6]報道的福州地區(qū)聽力障礙者常見耳聾基因突變篩查結(jié)果(26.14%)；其中龍巖市、南平市、三明市非綜合征型聾患者GJB2的突變檢出率最高，福州市12SrRNA突變檢出率最高，龍巖市12SrRNA突變檢出率最低，可能與12SrRNA突變?yōu)槟赶颠z傳，入選病例易出現(xiàn)家族聚集特征有關(guān)。本研究福州地區(qū)12SrRNA突變患者主要集中在3個家系，龍巖地區(qū)12SrRNA突變較低可能與無大家系入選有關(guān)。

GJB2基因突變導(dǎo)致的耳聾，一般為雙耳同時受累，聽力損失程度呈對稱性，少數(shù)表現(xiàn)為不對稱性，也有單耳受損報道。絕大多數(shù)GJB2基因突變致聾患者表現(xiàn)為先天性重度感音神經(jīng)性聾，高頻聽力或低高頻聽力同時受損，可以排除其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病，提示耳蝸受損部位主要位于耳蝸基底膜的蝸底及蝸頂區(qū)域，這對人工耳蝸電極的植入位置有參考價值[7]。本研究結(jié)果顯示，福建省606例非綜合征型聾患者主要檢出突變基因為GJB2基因，其235delC突變位點檢出率最高，與文獻報道的華北地區(qū)[8]、滕州地區(qū)[9]聾病患者、北京地區(qū)新生兒[10]檢測結(jié)果一致。但個別位點，如：511_512insAACG采用20個位點的飛行時間質(zhì)譜方法不能檢出，需要結(jié)合毛細(xì)管電泳測序法對GJB2編碼區(qū)序列測序驗證。

大前庭水管綜合征常合并耳蝸和/或半規(guī)管畸形，如：耳蝸畸形、前庭池擴大、半規(guī)管壺腹擴大等。SLC26A4基因突變與大前庭水管綜合征和耳蝸畸形有非常密切的關(guān)系，其導(dǎo)致的聽力下降呈進行性或波動性，輕度頭部外傷即可能誘發(fā)。確診SLC26A4基因突變的患者，可制定一套相應(yīng)的生活和治療指導(dǎo)方案，避免劇烈運動、頭部碰撞，以延緩聽力損失的發(fā)生或緩解病情[11]。本研究結(jié)果顯示，福建省606例非綜合征型聾患者SLC26A4基因突變位點主要是IVS7-2 A→G，與浙江省大前庭水管綜合征患者檢測結(jié)果一致[12]；本研究還發(fā)現(xiàn)另外6個較不常見的突變位點，如：754T→C、Exon1_Exon3Del、1686_1687insA、1079C→T、1707+5G→A、1646insA位點，采用20個位點的飛行時間質(zhì)譜方法不能檢出，建議同時進行CT檢查以排除大前庭水管綜合征。

攜帶線粒體12SrRNA基因1555A→G或1494C→T位點突變的個體是氨基糖苷類抗生素等耳毒性藥物的敏感個體，對氨基糖苷類抗生素高度敏感，小劑量應(yīng)用即可造成重度聽力損失，其耳聾的發(fā)生與用藥直接相關(guān)，主要臨床表現(xiàn)為耳聾、耳鳴、眩暈及平衡障礙，還可出現(xiàn)食欲減退、面部及手足麻木等癥狀。通過基因檢測，及早發(fā)現(xiàn)該基因突變攜帶者，及早對其進行干預(yù)，可有效預(yù)防藥物性聾的發(fā)生[5]。本研究結(jié)果顯示，福建省不同地區(qū)非綜合征型聾患者中均檢出了12SrRNA基因1555A→G突變，部分地區(qū)還有散發(fā)的12SrRNA基因1494C→T突變，建議在進行新生兒聽力篩查的同時，應(yīng)開展藥物性聾相關(guān)基因突變篩查。

GJB3基因突變可以引起常染色體顯性和隱性遺傳非綜合征型聾，常與高頻聽力下降有關(guān)，其常見突變位點為C538T、G547A[13]；本研究606例非綜合征型聾患者中未檢出GJB3基因突變，可能與福建省該基因突變率較低有關(guān)。

(致謝：感謝福建省殘聯(lián)楊殷秘書長、福州市、龍巖市、南平市、三明市聾啞學(xué)校老師、深圳華大基因在耳聾基因檢測過程中給予的幫助與支持。)