王文濤 陳賢明 謝三林 郭文玲

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)可能引起蛋白質(zhì)表達的質(zhì)或量的變化，這種變化可能與某些疾病的發(fā)生或易感性相關(guān)。谷氨酸是聽覺系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，代謝型谷氨酸受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布廣泛，在聽覺系統(tǒng)，代謝型谷氨酸受體分布于內(nèi)外毛細胞以及內(nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)細胞。有研究利用全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study,GWAS)發(fā)現(xiàn)歐洲老年人群感音神經(jīng)性聾與代謝型谷氨酸受體7(GRM7)基因的SNPs密切相關(guān)[1]；中國漢族老年男性感音神經(jīng)性聾患者也被發(fā)現(xiàn)與GRM7基因SNPs顯著相關(guān)，并且不同聽力下降類型者的基因多態(tài)性也存在差異[2]。上述研究對象均是50歲以上感音神經(jīng)性聾患者，較低年齡段的感音神經(jīng)性聾是否也與GRM7基因SNPs有相關(guān)性尚不清楚。為此，本研究選取年齡30～70歲的感音神經(jīng)性聾患者，分為30～50歲和51～70歲兩個年齡段組，分析各組GRM7基因相關(guān)位點，并與相同年齡段正常聽力人群比較，探討不同年齡段感音神經(jīng)性聾患者GRM7基因SNPs是否存在差異及其與年齡的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1研究對象及分組 研究對象納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡30～70歲，感音神經(jīng)性聾組耳聾特征符合雙耳對稱性聽力下降，初次就診，原因不明，言語頻率(500、1 000、2 000 Hz)平均聽閾≥26 dB HL，氣骨導(dǎo)差<10 dB。對照組為同齡段成年人，均為同期進行健康體檢者，耳科常規(guī)檢查無異常，言語頻率平均聽閾≤25 dB HL。排除標(biāo)準(zhǔn)：有外耳道、中耳疾病，有明確的長期噪聲暴露史，有耳毒性藥物接觸史，突發(fā)性聾、梅尼埃病等；ABR檢查懷疑有蝸后病變者；伴有嚴重全身性疾病，如：糖尿病、高血壓、心臟疾病、高脂血癥、慢性腎病、慢性阻塞性肺病等。選取符合納入及排除標(biāo)準(zhǔn)的906例漢族成年人感音神經(jīng)性聾患者為研究對象(試驗組)，分為A組(30～50歲)和B組(51～70歲)。A組467例，男236例，女性231例，平均年齡40.54±5.32，言語頻率聽閾26～120 dB HL,平均聽閾50.91±19.34 dB HL；B組439例，男208例，女231例，平均年齡62.02±3.44歲，言語頻率聽閾26～120 dB HL，平均聽閾53.53±18.44 dB HL。對照組分別為C組(30歲～50歲)和D組(51～70歲)。C組278例，男147例，女131例，平均年齡40.23±4.99，言語頻率聽閾-5～25 dB HL，平均聽閾9.22±6.39 dB HL；D組477例，男257例，女220例，平均年齡61.08±4.31歲，言語頻率聽閾-5～25 dB HL，平均聽閾11.33±6.25 dB HL。試驗組與對照組間低年齡段與高年齡段組間分別進行年齡和性別匹配分析，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗二者均無顯著差異，說明樣本年齡及性別均衡可比。本研究經(jīng)南京軍區(qū)福州總醫(yī)院倫理委員會論證同意，研究對象均同意參加研究并簽署知情同意書。

1.2GRM7基因多態(tài)性分析 抽取每位研究對象靜脈血液2 ml，EDTA2K抗凝管儲存于-20 ℃冰柜備用。參考Friedman等[1]和Luo等[2]有關(guān)GRM7基因多態(tài)性與耳聾易感性的研究，選擇rs11928865 和 rs11920109兩個位點分析不同年齡段感音神經(jīng)性聾患者及正常對照組成年人GRM7基因單核苷酸多態(tài)性?；蚍中筒捎肞CR擴增和Sequenom MassARRAY特定SNPs分析方法，基因組DNA提取采用QIAGEN公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit提取試劑盒，用標(biāo)準(zhǔn)提取方法從全血樣品中提取；引物設(shè)計結(jié)合文獻采用Assay Designer 3.1軟件，由北京六合華大基因科技公司合成(5'-AGAGCTGACCAAGTAGGAC-3'and5'-GGGATGTTCTGACAGCCAG-3')；運用 Sequenom MassARRAY技術(shù)對選定的2個SNP 位點進行樣本分型檢測，PCR擴增在384孔板的 PCR儀上設(shè)定，PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃ 15分鐘；94 ℃ 20秒，56 ℃ 30秒，72 ℃ 1分鐘，45個循環(huán)；72 ℃ 3分鐘；4 ℃保持。PCR分析后產(chǎn)物的測序由北京六合華大基因科技公司完成。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,應(yīng)用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗各組基因頻率的群體代表性；計量資料進行t檢驗，計數(shù)資料進行多層卡方檢驗或Fisher`s確切概率法檢驗，組間等位基因頻率和基因型頻率比較采用卡方檢驗，基因型的相對危險度以優(yōu)勢比(odds ratio，OR)及95%可信區(qū)間(95%CI)表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

GRM7基因rs11928865、rs11920109位點基因型和等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg 平衡檢驗，說明本研究納入的樣本具有隨機性和群體代表性。

由表1可見，GRM7 rs11928865位點基因型及等位基因頻率在A組與C組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.937, OR=1.035, 95% CI=0.787～1.360；GRM7 rs11920109位點基因型及等位基因頻率在A組與C組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.815, OR=1.052, 95% CI=0.815～1.300)。

表1 GRM7 rs11928865和rs11920109位點基因型分布及等位基因頻率在A組與C組間比較(例，%)

由表2可見，GRM7 rs11928865位點基因型在B組與D組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001, OR=1.463, 95% CI=1.136～1.884)；而GRM7 rs11920109位點基因型在B組與D組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.349, OR=0.864, 95% CI=0.712～1.047)。

表2 GRM7 rs11928865和rs11920109位點基因型分布及等位基因頻率在B組與D組間比較(例，%)

Logistic分析提示rs11928865位點TT與AT在B組與D組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001, OR=0.578, 95% CI=0.429～0.779)，TT與AA差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.260，OR=0.617，95% CI=0.266～1.429)(表3)。

表3 Logistic分析GRM7 rs11928865位點基因型在B組與D組間的比較(例)

3 討論

感音神經(jīng)性聾發(fā)病率與年齡密切相關(guān)，隨著年齡增長其發(fā)病率逐漸增加;環(huán)境因素與遺傳因素是感音神經(jīng)性聾的兩大病因，文獻報道遺傳因素占年齡相關(guān)性聾病因的35%～55%[3]。有研究發(fā)現(xiàn)部分基因異常，如：GJB2 基因突變[4]、GHRL2的移碼突變[5]以及鈣粘蛋白基因CDH23突變[6]等與年齡相關(guān)性感音神經(jīng)性聾有關(guān)，但大多數(shù)成年感音神經(jīng)性聾無典型家族遺傳現(xiàn)象。

SNPs可能引起蛋白質(zhì)表達的質(zhì)或量的變化，這種變化可能與某些疾病發(fā)生或疾病易感性相關(guān)。Friedman等[1]對來自歐洲國家的年齡在53～67歲的感音神經(jīng)性聾患者進行基因分析，發(fā)現(xiàn)耳聾組與對照組間存在GRM7基因單核苷酸多態(tài)性差異；Newman等[7]研究發(fā)現(xiàn)美國人群中GRM7基因與聽覺感知和言語識別有顯著關(guān)聯(lián)性。經(jīng)用Haploview software 4.2軟件分析，GRM7基因SNPs rs11928865、rs9877154、rs6804466和rs3828472位于單倍體1上，SNPs rs9819783、 rs11920109位于單倍體2上。rs11928865 和 rs11920109 具有連鎖不平衡(r2=0.173, D’=0.815, LOD=1.85), 因此，本研究選擇rs11928865 和 rs11920109兩個位點來分析GRM7基因單核苷酸多態(tài)與不同年齡段人群感音神經(jīng)性聾的相關(guān)性。

雖然多篇文獻報道GRM7基因SNPs與年齡相關(guān)性感音神經(jīng)性聾易感性有關(guān)[1,2,7]，但文獻中研究對象年齡、性別、種族、全身情況等均存在不同。Friedman等[1]的研究對象年齡是50歲以上且是歐洲群體，男女均有，其發(fā)現(xiàn)GRM7基因rs11928865等位基因和2個單倍體區(qū)(block6,7))在耳聾組和對照組間有顯著差異，提示GRM7 rs11928865與該組病例耳聾易感性相關(guān)。Newman等[7]研究對象是平均年齡為71.3歲的美國老年人，其發(fā)現(xiàn)GRM7基因SNPs不僅與耳聾易感性有關(guān)，還與研究對象的語言分辨率有關(guān)。Luo[2]選取的是70～100歲年齡段的中國男性人群為研究對象，且研究對象患有全身性疾病時也納入研究中，其發(fā)現(xiàn)rs11928865位點與中國老年男性雙耳對稱性感音神經(jīng)性聾顯著相關(guān)，并且不同聽力下降類型者該基因多態(tài)性也存在差異。從文中結(jié)果看，51～70歲年齡段雙耳對稱性感音神經(jīng)性聾組與同年齡段對照組GRM7基因rs11928865位點基因型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，認為GRM7基因rs11928865位點多態(tài)性與51～70歲年齡段組耳聾易感性相關(guān)；30～50歲年齡段耳聾組與對照組之間GRM7基因rs11928865位點基因型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義，認為GRM7基因rs11928865位點多態(tài)性與30～50歲年齡段耳聾易感性無相關(guān)性。

在臨床工作中發(fā)現(xiàn)部分中年人也表現(xiàn)出與老年性聾同樣特征的聽力下降，即部分聽力下降人群在全身其它器官還沒有表現(xiàn)出老齡變化時就已經(jīng)出現(xiàn)與老年性聾特征相同的雙耳對稱性感音神經(jīng)性聾。

本研究結(jié)果顯示GRM7基因rs11928865位點多態(tài)性與51～70歲年齡段組耳聾易感性相關(guān)，與30～50歲年齡段耳聾易感性無關(guān)，推測感音神經(jīng)性聽力損失發(fā)病年齡的差異可能與不同的遺傳病因有關(guān)；另外，本研究沒有發(fā)現(xiàn)rs11920109位點多態(tài)性與各耳聾組發(fā)病有相關(guān)性，這可能是由于感音神經(jīng)性聾是多基因致病的復(fù)雜性疾病，且環(huán)境因素、某些藥物、全身系統(tǒng)疾病及不良生活習(xí)慣等都有可能參與了這一過程。多基因疾病為多個微效基因共同致病,其不僅是多個微效基因易感性的聯(lián)合,還可能包括它們之間網(wǎng)絡(luò)性的相互作用,或者是兩者兼有。目前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)多個感音神經(jīng)聾的微效致病候選基因,包括GJB2基因[4,8，9]、GRHL2基因[5]、CDH23基因[6]、KCNQ4基因[10]、NAT基因[11～13]、APOE基因[14]、UCP2基因[15，16]等，很有可能它們是兩者、三者、抑或是更多相互作用而致??；進一步研究可能會發(fā)現(xiàn)有其它基因多態(tài)性與耳聾易感性有關(guān)。