郭敏 李書聆 李銳潔 江超武 張力 崔云華 王芳 朱蘭 阮標(biāo)

在遺傳性聾中，約22%為顯性遺傳，77%是 隱性遺傳，1%是X連鎖、線粒體突變母系遺傳或Y連鎖遺傳[1]。根據(jù)是否有其他系統(tǒng)的疾病還可以分為綜合征型聾和非綜合征型聾,大約30%的遺傳性聾為綜合征型聾[2];常見的綜合征型聾有Usher綜合征、瓦登伯格綜合征等。LEOPARD綜合征是一類少見的常染色體顯性遺傳的綜合征型聾，該綜合征患者除表現(xiàn)為耳聾外，還可有皮膚、心臟等的異常，大約85%的LEOPARD綜合征是由于PTPN11基因突變導(dǎo)致的[3]。本研究最近發(fā)現(xiàn)一個由PTPN11 c.1391G>C位點突變導(dǎo)致的LEOPARD綜合征家系，現(xiàn)將該家系的臨床表型特征及遺傳學(xué)檢查結(jié)果分析報告如下。

1 資料與方法

1.1研究對象 以先證者及家族成員為研究對象，先證者為女性，1歲4個月，因為未通過聽力篩查來昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科進行聽力診斷；其父母均為聾啞人，家系成員包括三代8名成員(圖1)。本研究通過了本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署了知情同意書，未成年人由監(jiān)護人簽署知情同意書。

1.2病史采集和全身體格檢查 對先證者及家族成員進行完整病史(出生史、耳聾病史、家族史、耳毒性藥物應(yīng)用史等)采集和系統(tǒng)的全身體格檢查。

1.3聽力檢測 對先證者進行聽性腦干反應(yīng)(ABR)、聲導(dǎo)抗、耳聲發(fā)射(OAE)檢查，對家族其他成員進行純音測聽和聲導(dǎo)抗檢查。依據(jù)歐洲工作組倡導(dǎo)的遺傳性聾分級標(biāo)準(zhǔn)進行耳聾程度分級[4]：輕度聾(20～40 dB HL)、中度聾(41～70 dB HL)、重度聾(71～95 dB HL)及極重度聾(>95 dB HL)。

1.4耳聾基因二代測序技術(shù) 抽取研究對象靜脈血3 ml，用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管保存，采用QIAamp DNA提取試劑盒(QIAGEN公司)抽提基因組DNA，對先證者進行已知的145個耳聾相關(guān)基因的外顯子區(qū)進行靶向測序分析。這145個基因包含非綜合征型耳聾基因和大部分綜合征型耳聾基因(參見http://hereditaryhearingloss.org/)。所有數(shù)據(jù)用BWA算法比對到參考序列(UCSC hg19)，采用儀器默認(rèn)設(shè)置[5]，對數(shù)據(jù)進行注釋[6]。經(jīng)篩選流程篩選，并結(jié)合患兒臨床資料和生物信息學(xué)軟件(Poly Phen2、Mutation Taster等)預(yù)測結(jié)果，對各個基因的功能、變異情況以及遺傳模式進行分析，得到可疑候選突變，最后通過PCR擴增和Sanger測序?qū)梢珊蜻x突變的位點進行驗證，并對患兒父母相應(yīng)位點進行檢測。PCR 擴增產(chǎn)物純化與測序工作由廣州金域檢驗所完成。選取聽力正常對照組100例(健康體檢人群)進行相應(yīng)位點的檢測，以排除遺傳學(xué)上常見的無功能多態(tài)。

2 結(jié)果

2.1家系表型及全身體檢結(jié)果 該家系表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳，3代8人中，有3人表現(xiàn)為耳聾，分別為先證者(Ⅲ-1)、先證者父親(Ⅱ-1)和母親(Ⅱ-2)，均為語前雙耳重度感音神經(jīng)性聾；其余家系成員均無耳聾病史。該家系的家系圖見圖1。

先證者及其父親心前區(qū)可聞及雜音，超聲心動圖檢查提示均有肥厚型心肌病。先證者父親面部和頸部還可見到多發(fā)痣。其他家族成員全身無異常。

2.2聽力檢查結(jié)果 先證者聽性腦干反應(yīng)左右耳氣導(dǎo)反應(yīng)閾為90 dB nHL，雙耳鼓室導(dǎo)抗圖為A型，耳聲發(fā)射不能引出；其父母雙耳純音聽閾均>90 dB nHL，雙耳鼓室導(dǎo)抗圖均為A型。家族另一成員(Ⅱ-3)純音聽閾正常。

圖1該家系常染色體顯性遺傳性聾家系圖

2.3耳聾基因檢測結(jié)果和生物學(xué)分析 通過二代測序，提示先證者及其父親攜帶PTPN11基因c.1391G>C位點突變(圖2)；先證者母親及對照組未發(fā)現(xiàn)該位點突變。使用Poly Phen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index) 和 Mutation Taster (http://www.mutationtaster.org/)進行突變對氨基酸功能影響的預(yù)測，提示該突變是一已知致病突變，會使編碼蛋白的464位置的Gly 變成Ala (p. Gly 464 Ala)，從而可能改變蛋白的功能；查詢dbSNP, HGMD, 1000 Genomes Project, ClinVar and ESP6500數(shù)據(jù)庫，未發(fā)現(xiàn)中國人有此突變的報道。

圖2 先證者及其父親PTPN11基因c.1391G>C突變測序峰圖

3 討論

LEOPARD綜合征(LS, OMIM 151100) 是1936年由Zeisler and Becker 首次報道[3]，該綜合征的命名是由其臨床特征的首字母組成：多發(fā)痣(multiple lentigines)、心電圖傳導(dǎo)異常(ECG conduction abnormalities)、 眼距過寬(ocular hypertelorism)、肺動脈狹窄(pulmonic stenosis)、 生殖器異常(abnormal genitalia)、 發(fā)育遲緩(retardation of growth)以及感音神經(jīng)性聾(sensorineural deafness)。該綜合征也曾被稱為多發(fā)痣綜合征(lentigines syndrome)、心臟皮膚綜合征(cardio-cutaneous syndrome)、 莫尼漢綜合征(Moynahan syndrome)等[7]。

LEOPARD綜合征為常染色體顯性遺傳性疾病，可以是散發(fā)的，也可以是家族性的顯性遺傳，一旦父母一方患病，有50%的機率遺傳給下一代。大約85%的LEOPARD綜合征是由于PTPN11基因的錯義突變導(dǎo)致的，該基因位于染色體12q24.1[8,9]。PTPN11基因負(fù)責(zé)編碼SRC同源結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酶 (SHP2) 蛋白，該蛋白具有兩個串聯(lián)排列的SH2結(jié)構(gòu)域(N-SH2和C-SH2)和一個蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)結(jié)構(gòu)域；SHP2的功能是作為生長因子、細胞因子和激素的信號下調(diào)受體，并通過RAS-絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑發(fā)揮特殊作用[3,10,11]。PTPN11突變可以導(dǎo)致LEOPARD 綜合征和Noonan 綜合征 (NS) (OMIM: 163950)，50%的Noonan 綜合征是由于PTPN11 突變引起[10]。雖然基因?qū)W相似，但是這兩種綜合征具有不同的表現(xiàn)和機制；LEOPARD 綜合征患者基因突變是下調(diào)蛋白酪氨酸磷酸酶活性，而Noonan 綜合征患者基因突變則會上調(diào)該酶的活性[12,13]；相對于LEOPARD 綜合征，Noonan 綜合征更常見一些，其主要特征是身材矮小和面部畸形以及合并/不合并肥厚型心肌病[14,15]。

對于LEOPARD 綜合征患者，心電圖異常和進行性心肌傳導(dǎo)異常是最常見的心臟疾病，通常肥厚型心肌病是威脅患者生命最常見的疾病[16～18]。多發(fā)痣是LEOPARD 綜合征患者的一個特征表現(xiàn)，但是通常很少出現(xiàn)在5歲以下的患兒[8];LEOPARD 綜合征患者的多發(fā)痣是扁平的、黑色至棕色的，主要分布在患者面部、頸部和上部軀干。感音神經(jīng)性聾僅發(fā)生于15%～25%的LEOPARD 綜合征患者[9,19]，大多數(shù)患者都是出生后即出現(xiàn)耳聾，以后逐漸發(fā)展成為全聾。因此，對于LEOPARD 綜合征患者來說，耳聾不像多發(fā)痣那樣容易成為該疾病診斷線索。文中報道的這個家系中的先證者及患者就是以耳聾為首發(fā)癥狀，通過耳聾基因檢測和家族成員的綜合檢查才得以確診，從而進一步發(fā)現(xiàn)了患者及其家屬的心臟和皮膚的異常。因此，詳細了解耳聾患者的家族史和全身表現(xiàn)，同時對疑難病例進行基因檢測，有助于正確的診斷和治療。

目前研究顯示PTPN11錯義突變多位于7號、8號、12號和13號外顯子，其中7號和12號外顯子突變與肥厚型心肌病相關(guān)，8號外顯子突變與肺動脈狹窄相關(guān)[20]。 對該家系的基因檢測顯示，先證者及其父親是由于PTPN11 基因的c.1391G>C突變致病，該突變位點位于PTPN11 基因12號外顯子，為一雜合錯義突變；使用Poly Phen-2 和Mutation Taster 進行查詢和功能預(yù)測，提示該突變是一已知致病突變，會使編碼蛋白的464位置的Gly 變成Ala (p. Gly 464 Ala)，從而可能改變蛋白的功能。通過查詢ClinVar等數(shù)據(jù)庫，該突變曾于2004年由Yoshida等首次報道[21]，然而在中國人群中目前尚無此位點突變的報道，本研究結(jié)果豐富了我國綜合征型聾的基因譜。

綜上所述，本研究通過聽力學(xué)檢查顯示聽力異常，體檢發(fā)現(xiàn)多發(fā)痣，超聲心動圖發(fā)現(xiàn)肥厚型心肌病，基因檢測發(fā)現(xiàn)PTPN11 基因的c.1391G>C突變，明確了該耳聾家系的病因、臨床表型和遺傳特征，確診先證者及其父親為LEOPARD綜合征，后續(xù)的干預(yù)措施為轉(zhuǎn)診患兒及其父親到心內(nèi)科門診進行治療和隨訪，并對該家系進行遺傳指導(dǎo)，同時建議先證者進行人工耳蝸植入手術(shù)。