李偉學(xué) 田宋君 詹爭明 林先盛

1武漢科技大學(xué)附屬漢陽醫(yī)院普外科（武漢430050）；2安徽省立醫(yī)院普外科（合肥 230001）

目前研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)前對腫瘤的T分期、淋巴轉(zhuǎn)移情況及Duckes分期影響結(jié)直腸癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素，除此之外手術(shù)中的麻醉方式、圍術(shù)期輸血及治療方式也是相關(guān)影響因素［1-3］。但是上述因素多基于肝轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移展開，卻鮮見結(jié)直腸癌骨轉(zhuǎn)移的影響因素分析。同樣也缺少可靠的，可以預(yù)測結(jié)直腸癌骨轉(zhuǎn)移的潛在指標(biāo)。TSAI等［4］研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者術(shù)前血清中癌胚抗原（CEA）與糖類抗原199（CA199）水平可作為評估結(jié)直腸癌臨床病理關(guān)系的指標(biāo)之一，亦有學(xué)者提出多種病理學(xué)指標(biāo)與結(jié)直腸癌病情轉(zhuǎn)歸息息相關(guān)［5］，但未見關(guān)于骨轉(zhuǎn)移不良預(yù)后的報(bào)道。因此，本研究通過對本院的結(jié)直腸癌患者進(jìn)行跟蹤隨訪，探索其接受結(jié)直腸癌根治術(shù)后發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的主要影響因素，并探索其潛在的預(yù)測骨轉(zhuǎn)移指標(biāo)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2007年1月-2011年1月我院確診并收治的結(jié)直腸癌患者作為研究對象，共513例，其中女141例，男372例，平均年齡（63.59±12.45）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前未進(jìn)行化療或生物治療等干預(yù)；（2）進(jìn)行根治性切除手術(shù)；（3）術(shù)后病理證實(shí)為腺癌或黏液腺癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并感染及其他系統(tǒng)疾病等對炎性反應(yīng)指標(biāo)有影響的疾病；（2）出現(xiàn)消化系統(tǒng)出血、梗阻以及穿孔等急診手術(shù)患者；（3）術(shù)前檢查發(fā)現(xiàn)已合并或轉(zhuǎn)移多處腫瘤；（4）術(shù)后局部復(fù)發(fā)或3個月內(nèi)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；（5）結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)二次手術(shù)者。所有患者及家屬均簽署知情同意書，該研究獲倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料記錄 患者入院后以問詢的方式整理并收集完整臨床資料，包括性別、年齡、身高、體重、病程、病史，結(jié)合影像學(xué)檢查及其他檢查記錄合并癥、腫瘤位置、腫瘤大小、病理學(xué)類型、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。

1.2.2 術(shù)前相關(guān)指標(biāo)檢測 治療前及手術(shù)后第2周，采用羅氏ELECSYS 2010全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，患者晨起空腹?fàn)顟B(tài)下抽取靜脈血液3 mL，依次進(jìn)行抗凝、離心，取血漿置Eppendorf管中，在-80℃的冰箱中冷凍保存待檢。CA242含量測定：CA242雙抗體直接夾心診斷試劑盒（北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司）測定血清CA242含量；CEA含量測定：ELISA法直接檢測血清CEA濃度；CA199含量測定：配套CA199試劑，對患者進(jìn)行空腹采血2 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)操作檢測CA199含量。

1.2.3 手術(shù)治療 患者入院后予以二級護(hù)理，低鹽低脂飲食，術(shù)前進(jìn)行灌腸、控制血壓血糖、備血等術(shù)前準(zhǔn)備，患者均進(jìn)行根治性D3術(shù)式。（1）患者接受開腹式結(jié)直腸癌根治術(shù)，嚴(yán)格遵循腫瘤根治原則進(jìn)行手術(shù)操作，保持直腸系膜的環(huán)切緣完整切除，保證兩端足夠切緣。直腸癌及乙狀結(jié)腸下段癌數(shù)千鈞常規(guī)進(jìn)行直腸腔內(nèi)5-氟尿嘧啶化療。術(shù)中遵守?zé)o瘤操作及腫瘤整塊切除原則，在關(guān)閉腹腔前對腫瘤侵及腸壁漿膜者用溫?zé)嵴袅锼磸?fù)沖洗腹腔并將5-氟尿嘧啶置入腹腔中。（2）患者接受腹腔鏡結(jié)直腸癌根治術(shù)，嚴(yán)格遵循腫瘤根治原則進(jìn)行手術(shù)操作，建立氣腹，氣腹壓保持12～14 mmHg，在分離腸段、結(jié)扎血管、清掃淋巴結(jié)后，將腫瘤切除并裝入自制尼龍袋從腹壁切口取出，盡量避免腫瘤組織與切口直接接觸，最后進(jìn)行吻合腸段。術(shù)后給予一級護(hù)理，密切觀察電解質(zhì)平衡和炎癥發(fā)生，早期制定規(guī)范的輔助放、化療方案。如有其他不適進(jìn)行對癥處理，手術(shù)過程見圖1。

圖1 結(jié)直腸癌手術(shù)圖片F(xiàn)ig.1 Images of surgery for colorectal cancer

1.2.4 術(shù)后相關(guān)指標(biāo)檢測 鼠抗人表皮生長因子受體（EGFR）單克隆抗體（MAB-0196）、鼠抗人人類表皮生長因子受體2（HER2）單克隆抗體（MAB-0198），均購于杭州瑞晶有限公司。對二甲氨基偶氮苯（DAB）購于上海源葉生物科技有限公司。儀器均由我院提供，包括：石蠟切片機(jī)、奧林巴斯CX23顯微鏡及電熱恒溫干燥箱（56～65℃）。

手術(shù)中切除標(biāo)本經(jīng)固定（10%福爾馬林）、包埋（石蠟）、切片至4 μm厚度后，采用免疫組化法進(jìn)行檢測。二甲苯與梯度乙醇（100%、95%、85%）處理切片各3 min進(jìn)行常規(guī)脫蠟脫水，PBS試劑反復(fù)沖洗，加入3%過氧化氫-甲醇溶液靜置10 min。每張切片加入50 μL非特異性血清靜置10 min以消除非特異性染色，加入一抗，37℃下孵育2 h，PBS洗凈，滴加二抗孵育0.5 h。DAB顯色3～10 min，水洗、蘇木精復(fù)染、脫水、封固。請我院病理科2位專家于顯微鏡下觀察結(jié)果，全程雙盲。HER2的陽性著色區(qū)位于胞膜，胞膜棕黃色顆粒樣視為HER2陽性結(jié)果；EGFR的陽性著色區(qū)位于胞膜、胞質(zhì)，胞膜及胞質(zhì)出現(xiàn)黃棕色染色視為EGFR陽性結(jié)果。見圖2。

結(jié)果判定：（-）切片無陽性顯色細(xì)胞；（+）淺黃色，陽性細(xì)胞在切片中的分布范圍5%～25%；（++）棕黃色，陽性細(xì)胞分布范圍26%～50%；（+++）深棕黃色，陽性細(xì)胞分布范圍＞50%。

1.2.5 術(shù)后隨訪 對所有參與研究的患者進(jìn)行為期5年的隨訪，首次隨訪為治療結(jié)束后3個月后，之后每隔6個月電話隨訪一次。終點(diǎn)事件定義為：患者隨訪期間發(fā)現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移或出現(xiàn)其他器官轉(zhuǎn)移。確診出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移時，對患者進(jìn)行腹部或盆腔增強(qiáng)CT復(fù)查，對于疑似患者采用骨發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層掃描進(jìn)行骨轉(zhuǎn)移確診，或進(jìn)行病理證實(shí)發(fā)生骨轉(zhuǎn)移?；颊呔芙^訪問、中途退出、死于與骨轉(zhuǎn)移無關(guān)原因的定義為失訪。根據(jù)隨訪結(jié)果，將出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移的患者定義為骨轉(zhuǎn)移組，其余患者定義為對照組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，對于性別等計(jì)數(shù)資料用例數(shù)表示。根據(jù)隨訪結(jié)果，計(jì)算不良預(yù)后率并繪制生存曲線。對于可能影響結(jié)直腸癌術(shù)后骨轉(zhuǎn)移的因素，采用單因素、多因素Cox回歸進(jìn)行分析。篩選后建立ROC曲線評價(jià)潛在指標(biāo)對結(jié)直腸癌根治術(shù)后骨轉(zhuǎn)移的預(yù)測能力。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料分析 本次研究共收錄結(jié)直腸癌患者513例，年齡27～83歲，平均（63.59± 12.45）歲，平均腫瘤大小為（5.49±0.66）cm；平均淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為9.45個；平均術(shù)前CEA水平為（21±17.47）μg/L，平均術(shù)后CEA水平為（17.35±23.62）μg/L；平均術(shù)前CA199水平為（75±21.24）kU/L，平均術(shù)后CA199水平為（83.30±12.74）kU/L；平均術(shù)前CA242水平為（41.32±36.85）U/mL，術(shù)后為（33.94±32.16）U/mL。513例病患中，276例組織切片EGFR呈陽性，其中，等級為（+）的患者有55例，等級為（++）的患者有103例，等級為（+++）的患者有118例，其平均陽性表達(dá)率為（40.21±8.45）%。341例的組織切片呈現(xiàn)HER2陽性表達(dá)結(jié)果，122例為（+），82例為（++），余下137例為（+++），平均陽性表達(dá)率為（57.83±11.62）%。

2.2 隨訪結(jié)果 在隨訪結(jié)束時，全體患者失訪27例，210例到隨訪結(jié)束未發(fā)生終點(diǎn)事件，276例出現(xiàn)了終點(diǎn)事件，其中24例為骨轉(zhuǎn)移。Kaplan?Meier生存曲線（圖3），經(jīng)計(jì)算，患者的骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率為4.94%。

圖2 免疫組化染色圖片F(xiàn)ig.2 Immunohistochemical staining

2.3 影響結(jié)直腸癌根治術(shù)后骨轉(zhuǎn)移預(yù)后情況的單因素分析 單因素分析結(jié)果顯示：腫瘤位置、腫瘤類型、浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移、術(shù)前CEA水平、術(shù)后CEA水平、術(shù)前CA199水平、術(shù)前CA242水平、TNM分期、EGFR陽性表達(dá)（+++）、HER2陽性表達(dá)（++）及（+++）、細(xì)胞分化程度及是否伴隨肺轉(zhuǎn)移對患者骨轉(zhuǎn)移有影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而患者性別、年齡、平均腫瘤大小、手術(shù)類型、術(shù)后CA199、術(shù)后CA242及細(xì)胞增殖程度對患者術(shù)后骨轉(zhuǎn)移并無明顯影響（P＞0.05）。

圖3 結(jié)直腸癌根治術(shù)手預(yù)后不良率的生存曲線Fig.3 Survival curves of poor prognosis rate in colorectal cancer

2.4 影響結(jié)直腸癌根治術(shù)后骨轉(zhuǎn)移預(yù)后情況的多因素Cox比例回歸分析 多因素Cox回歸結(jié)果顯示：細(xì)胞分化程度（P=0.018）、浸潤深度（P=0.038）、EGFR陽性表達(dá)（+++）（P=0.013）、HER2陽性表達(dá)（+++）（P=0.026）、術(shù)后CEA水平（P=0.002）、術(shù)前CA199水平（P=0.001）及術(shù)前CA242水平（P=0.031）對患者骨轉(zhuǎn)移有影響；腫瘤位置、類型，是否肺轉(zhuǎn)移，TNM分期，術(shù)前CEA，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對患者骨轉(zhuǎn)移的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.5 ROC曲線評價(jià)三種檢查方法診斷結(jié)直腸癌骨轉(zhuǎn)移效能 運(yùn)用ROC曲線結(jié)果顯示：術(shù)后CEA水平、術(shù)前CA199水平、術(shù)前CA242水平的AUC分別為0.814、0.774、0.801；選取術(shù)前 CA242與術(shù)后CEA做聯(lián)合診斷，其AUC為0.885，其預(yù)測的敏感性和特異性分別為88.5%、84.8%。

3 討論

結(jié)直腸癌浸潤可通過淋巴管、血管和神經(jīng)這三種途徑，其中血管浸潤更容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，通過門靜脈和下腔靜脈進(jìn)行較早的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，包括骨轉(zhuǎn)移［6-7］。在治療早期，應(yīng)密切關(guān)注結(jié)直腸癌浸潤程度，對轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)進(jìn)行仔細(xì)排查，對于浸潤程度高或已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的應(yīng)提前準(zhǔn)備放化療方案，在根治術(shù)后進(jìn)行常規(guī)治療。除此之外，病理學(xué)指標(biāo)EGFR、HER2是腫瘤檢測及預(yù)后影響因素中研究較新關(guān)注點(diǎn)較高的一類指標(biāo)，我國學(xué)者宋均飛等［8］在其研究中證實(shí)EGFR、HER2在結(jié)直腸癌

患者中異常高表達(dá)，有望作為新的腫瘤標(biāo)志物。EGFR與HER2均是受體酪氨酸激酶受體家族成員之一，EGFR高度親和表皮生長因子，一旦表達(dá)過量，可迅速激活本身的酪氨酸激酶，為腫瘤細(xì)胞增殖分化提供信號，同時促進(jìn)新生血管生成［9-10］。HER2的結(jié)構(gòu)和功能與EGFR較為相似，二者聯(lián)合表達(dá)對腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移呈現(xiàn)協(xié)同作用［11-12］。在本文研究中，單多因素COX回歸結(jié)果顯示EG?FR及HER2的高度陽性表達(dá)是結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的影響因素，提示EGFR及HER2的早期篩查確有一定價(jià)值，可作為協(xié)同預(yù)測指標(biāo)。

表1 結(jié)直腸癌根治術(shù)后骨轉(zhuǎn)移預(yù)后影響因素的單因素分析Tab.1 Single factor analysis of factors influencing prognosis of bone metastases after colorectal cancer surgery

表2 結(jié)直腸癌根治術(shù)后骨轉(zhuǎn)移預(yù)后影響因素的多因素分析Tab.2 Multifactor analysis of factors influencing prognosis of bone metastases after colorectal cancer surgery

圖4 術(shù)后CEA水平、術(shù)前CA199水平及術(shù)前CA242水平診斷骨轉(zhuǎn)移的ROC曲線分析Fig.4 ROC curve analysis of bone metastases by postoperative CEA，preoperative CA199，and preoperative CA242

在結(jié)直腸癌中，CEA水平作為糖類抗原對癌癥發(fā)生有較高的敏度度和特異度，在不同的病例程度下，術(shù)前術(shù)后CEA水平在血清中表達(dá)也隨之不同［13-15］。在本研究中，除了術(shù)后CEA水平，術(shù)前CA199水平及術(shù)前CA242也是術(shù)后骨轉(zhuǎn)移的影響因素。CA199水平越高，預(yù)后越差。雖然腫瘤標(biāo)志物水平并不能作為確診或診斷結(jié)直腸癌，或直接判斷發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，但可聯(lián)合多指標(biāo)預(yù)測術(shù)后轉(zhuǎn)歸情況，提高預(yù)測敏感性。

對以上危險(xiǎn)因素進(jìn)行多因素Cox比例回歸分析發(fā)現(xiàn)，術(shù)前CA199水平與術(shù)前CEA水平對結(jié)直腸癌術(shù)后骨轉(zhuǎn)移影響最大。根據(jù)以上相關(guān)危險(xiǎn)因素，本研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合術(shù)后CEA水平和術(shù)前CA242水平評估患者骨轉(zhuǎn)移，其敏感性相比二者單獨(dú)預(yù)測時均有提高，聯(lián)合檢測敏感性可高達(dá)88.95%，且血清檢查較為方便。因此，結(jié)直腸癌根治術(shù)后患者應(yīng)按時進(jìn)行血清檢查，建議患者術(shù)后2周進(jìn)行CEA水平及CA242水平血清檢查進(jìn)行術(shù)后復(fù)查，術(shù)后3年應(yīng)3～6個月進(jìn)行一次CEA水平及CA242水平血清檢查，及時檢查腫瘤標(biāo)記物以進(jìn)行預(yù)后干預(yù)。

然而，本研究結(jié)果僅有腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)，病理學(xué)指標(biāo)主要以分類變量表示，在一定程度上影響了結(jié)果的準(zhǔn)確性；本研究雖然得出了相關(guān)危險(xiǎn)因素，但未能解釋危險(xiǎn)因素影響病程進(jìn)展的根本原因，只能對預(yù)后進(jìn)行預(yù)防。

綜上所述，本研究表明術(shù)后CEA水平、術(shù)前CA242、術(shù)前CA199水平、浸潤深度、細(xì)胞分化程度、EGFR（+++）和HER2（++）、（+++）是結(jié)直腸癌根治術(shù)后骨轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，術(shù)后CEA水平和術(shù)前CA242水平二者聯(lián)合檢測可對骨轉(zhuǎn)移預(yù)后進(jìn)行預(yù)測，以此提高患者預(yù)后情況。