黃迪 黃宇 翁杰鋒 黃子圣 麥振豪 趙俐 古維立

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院普通外科（廣州510180）；2廣州消化疾病中心（廣州510180）；3華南理工大學(xué)第二附屬醫(yī)院普通外科（廣州510180）

乳腺癌是一種嚴(yán)重危害女性健康的常見惡性腫瘤。近40年來，乳腺癌的發(fā)病率位居全球首位，全球每年有140萬婦女被確診為乳腺癌［1］。近幾十年來，盡管放療、化療及多種生物治療手段有了長足發(fā)展，然而，乳腺癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及化療耐藥等仍是乳腺癌治療的難題。有證據(jù)表明［2-4］，reversine可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但是目前國內(nèi)應(yīng)用reversine作用乳腺癌的研究極為少見，特別是用于三陰性乳腺癌41T細(xì)胞的研究尚未見報道。因此，本研究旨在探討rever?sine對小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞的增殖和凋亡的影響，并探究其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞株（中山大學(xué)動物實驗中心）；藥物reversine（SIMGA公司）；CCK?8試劑盒（上海東仁化學(xué)科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)基干粉、胎牛血清、DMSO（美國Sigma公司）；TGF?beta、TIMP1、MMP9抗體（Abcam公司）；Caspase?3、bax、bcl?2 抗體（Cell Signaling公司）；Aurora B 抗體（Novusbio公司）；Annexin?V?FITC/PI凋亡試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；RIPI裂解液（碧云天生物技術(shù)公司）；Millipore聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、電化學(xué)（ECL）發(fā)光液、垂直電泳槽、Western blot電泳儀、Western blot轉(zhuǎn)膜儀、FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；多功能酶標(biāo)儀（香港基因有限公司）；IX51倒置相差顯微鏡（日本Olympus）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 4T1細(xì)胞用體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清加1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，于二氧化碳培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中培養(yǎng)，隔天換液，傳代時間為3～4 d，傳代前用2.5 g/L的胰酶消化。以加入DMSO的4T1細(xì)胞作為正常對照組；以reversine終濃度分別為 10、25、50 μg/mL 為實驗組，每組藥物干預(yù)時間為24 h。

1.2.2 CCK?8法檢測 取對數(shù)期生長的細(xì)胞，設(shè)立空白對照組，24 h后加入CCK?8試劑，與培養(yǎng)基按1∶10的比例加入，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，多功能酶標(biāo)儀檢測波長為450 nm處的吸光度OD值。實驗重復(fù)3次。細(xì)胞抑制率計算方法：細(xì)胞抑制率=1-（加藥組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測 取對數(shù)期生長的細(xì)胞，按照分組情況加入藥物干預(yù)，24 h后胰酶消化收集細(xì)胞，1×PBS洗滌細(xì)胞2次，制成細(xì)胞懸液，用300目濾網(wǎng)過濾，收集濾液，計數(shù)取1×105個細(xì)胞，離心后用500 μL的Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V?FITC以及5 μL PI，混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，1 h內(nèi)完成檢測。每組實驗重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot檢測 分別收集各組細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)后，進(jìn)行SDS?PAGE電泳（分離膠10%，濃縮膠5%），每孔加入50 μg蛋白質(zhì)，恒壓100 V電泳至分離膠底部，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，脫脂牛奶室溫封閉1 h，按照抗體說明書稀釋抗體，4℃孵育過夜，PBST洗滌3次，每次15 min。再加入1∶2 000稀釋的二抗，室溫?fù)u床振搖1 h，PBST洗滌3次，ECL試劑顯色、曝光并拍照，掃描后用Image?Pro?Plus圖像分析軟件進(jìn)行光密度積分值（Integral of optical density）分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS 13.0軟件，多組間均數(shù)差異性比較采用單因素方差分析（One?way ANOVA），數(shù)據(jù)均以±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 reversine對小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞的增殖抑制作用 如圖1所示，隨著濃度的增加，reversine對4T1細(xì)胞的抑制率也隨之增加，在同一濃度下，reversine干預(yù)48 h比干預(yù)24 h對細(xì)胞的抑制更強，呈現(xiàn)時間劑量對應(yīng)關(guān)系。不同濃度reversine對細(xì)胞形態(tài)的影響見圖2。

圖1 reversine對小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞的增殖抑制作用Fig.1 Effect of reversine on proliferation of mouse breast cancer 4T1 cells

2.2 reversine對小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞凋亡率的影響 流式細(xì)胞檢測凋亡結(jié)果如圖3，不同濃度reversine對小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率的情況見表1。低濃度組（10 μg/mL）細(xì)胞早期、晚期以及總凋亡率有所增加，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義。中濃度組（25 μg/mL）及高濃度組（50 μg/mL）細(xì)胞早期、晚期以及總凋亡率明顯增加，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 Caspase?3、bax、bcl?2 蛋 白 表 達(dá)的變化Western blot檢測各組細(xì)胞中 Caspase?3、bax、bcl?2蛋白表達(dá)如圖4所示，利用IPP圖像分析軟件對各蛋白條帶定量，結(jié)果（圖5）應(yīng)用reversine能夠顯著增加活化的Caspase?3的表達(dá)，隨著加藥濃度的增加bax/bcl?2的比值也增大。

圖2 reversine對4T1細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.2 Effect of reversine on mouse breast cancer 4T1 cells

圖3 reversine對小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞凋亡率的影響Fig.3 Effect of reversine on apoptosis of mouse breast cancer 4T1 cells

表1 不同濃度reversine對小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率的影響Tab.1 Flow cytometry was adopted to detect the effect of reversine on the apoptosis of mouse breast cancer 4T1 cells

圖4 Western blot檢測各組細(xì)胞中Caspase?3、bax、bcl?2蛋白的表達(dá)情況Fig.4 Western blot was conducted to detect the expression of Caspase?3，bax，bcl?2 protein

圖5 活化的Caspase?3和bax/bcl?2比值定量分析情況Fig.5 Expression of Caspase?3 and bax/bcl?2 ratio of reversine on mouse breast cancer 4T1 cells

2.4TGF?β1、TIMP1、MMP9和Aurora B蛋白表達(dá)情況 Western blot檢測各組細(xì)胞中TGF?β1、TIMP1、MMP9和Aurora B蛋白表達(dá)（圖6），利用IPP圖像分析軟件對各蛋白條帶定量，結(jié)果（圖7）發(fā)現(xiàn)應(yīng)用reversine后 TGF?β1表達(dá)無差別，rever?sine能夠下調(diào)4T1細(xì)胞中TIMP1、MMP9和Aurora B蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

Reversine是一種人工合成的小分子的嘌呤衍生物，它可以令已分化的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槲捶只淖婕?xì)胞［5］，這一特性使得該藥物在再生醫(yī)學(xué)方面受到廣泛關(guān)注［6-10］。近年來研究發(fā)現(xiàn)reversine在體外細(xì)胞實驗具有抗腫瘤作用，對甲狀腺癌細(xì)胞［2，4］、口腔鱗狀細(xì)胞癌［3］、宮頸癌［11］、骨髓癌［12］等的治療具有一定作用。

圖6 Western blot檢測各組細(xì)胞中TGF?β1、TIMP1、MMP9和Aurora B蛋白的表達(dá)情況Fig.6 Western blot was conducted to detect the expression of TGF?β1，TIMP1，MMP9 and Aurora B protein

4T1細(xì)胞是一種雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體-2（Her?2）均為陰性的乳腺癌細(xì)胞。三陰性乳腺癌發(fā)病年齡小，最具侵襲性、轉(zhuǎn)移率高且預(yù)后不良，常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)的化療治療預(yù)后較差，仍為臨床上治療的難點。雖現(xiàn)階段研究發(fā)現(xiàn)具有BRCA1/2基因變異的三陰性乳腺癌應(yīng)用鉑類效果較佳，但三陰性乳腺癌仍為當(dāng)今乳腺癌治療的挑戰(zhàn)。本研究利用reversine對小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞進(jìn)行體外實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)reversine可以抑制小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞的增殖，高濃度組（50 μg/mL）處理48 h后，50%的細(xì)胞生長受到抑制。Aurora B是一種促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的關(guān)鍵蛋白，既往針對reversine的研究發(fā)現(xiàn)該藥物是通過Aurora B這一通路使細(xì)胞去分化。本實驗中west?ern blot檢測發(fā)現(xiàn)reversine能顯著下調(diào)4T1細(xì)胞Aurora B蛋白的表達(dá)來抑制細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)reversine可以促進(jìn)4T1細(xì)胞凋亡，其作用機制與促進(jìn)活化的 Caspase?3 表達(dá)、增加 bax/bcl?2比值有關(guān)。

圖7 TGF?β1、TIMP1、MMP9和Aurora B蛋白定量分析Fig.7 Expression of TGF?β1，TIMP1，MMP9和Aurora B protein of reversine on mouse breast cancer 4T1 cell

乳腺癌轉(zhuǎn)移是多步驟發(fā)展的過程，表現(xiàn)為：具有侵襲轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細(xì)胞脫離原發(fā)灶開始浸潤周圍組織，穿透血管壁進(jìn)入血液，通過血液循環(huán)進(jìn)行遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，最后在遠(yuǎn)處器官上形成新的轉(zhuǎn)移灶。現(xiàn)階段的研究發(fā)現(xiàn)影響乳腺癌轉(zhuǎn)移的因素包括轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF?β）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、組織金屬蛋白酶抑制物（TIMPs）和外泌體等。轉(zhuǎn)化生長因子TGF?β1是人體組織細(xì)胞內(nèi)具有調(diào)控功能的細(xì)胞因子，在細(xì)胞增殖及凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［13］，既往的研究也發(fā)現(xiàn)rever?sine對細(xì)胞的作用機制與TGF?β1相關(guān)［14］。有研究表明TGF?β1的表達(dá)與多種惡性腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后有關(guān)［15-17］。本研究發(fā)現(xiàn)reversine對4T1細(xì)胞TGF?β1的表達(dá)沒有影響。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是其難以根治的主要原因，基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs與TIMPs間活性的平衡決定著細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）降解與否。有研究表明，MMP9和TIMP1表達(dá)失衡與乳腺癌浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［18-19］，乳腺癌組織中的TIMP1含量越高其預(yù)后越差［20］。本研究通過應(yīng)用reversine干預(yù)4T1細(xì)胞，了解reversine作用乳腺癌的相關(guān)機制，結(jié)果顯示reversine可以顯著減低4T1細(xì)胞中MMP9和TIMP1蛋白的表達(dá)，提示re?versine有可能通過下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中MMP9和TIMP1蛋白的表達(dá)來減少細(xì)胞侵襲，但具體通路尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，reversine可以抑制小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，reversine可能成為一種治療乳腺癌的潛在藥物，其具體的機制仍有待進(jìn)一步研究。