李淑靜 張愛東 袁博 杜曉娟 羅曉冰 趙夢(mèng) 王樂(lè) 杜金杰

1承德護(hù)理職業(yè)學(xué)院（河北承德067000）；2承德醫(yī)學(xué)院（河北承德067000）

胰腺癌是全球常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，胰腺癌位列癌癥相關(guān)死亡的第4位，預(yù)計(jì)到2017年美國(guó)地區(qū)新發(fā)胰腺癌將達(dá)到53 670例，因胰腺癌死亡病例將達(dá)到43 090例［1-2］。中國(guó)國(guó)家癌癥中心的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，2015年全國(guó)男性和女性胰腺癌發(fā)病率分別為52.2/10萬(wàn)和37.9/10萬(wàn)，病死率則分別為45.6/10萬(wàn)和33.8/10萬(wàn)［3］。胰腺癌發(fā)病隱匿，較早發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及化療不敏感及耐藥性是胰腺癌病死率高的主要因素。

近些年來(lái)，多靶點(diǎn)抗癌藥物研發(fā)已經(jīng)成為新型腫瘤治療藥物研發(fā)的焦點(diǎn)。舒尼替尼（sunitinib、SU11248）是一種多靶點(diǎn)的生物靶向抗腫瘤藥物，是多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，能同時(shí)抑制多條信號(hào)傳導(dǎo)通路，具有抗腫瘤和抗血管生成作用［4］。舒尼替尼在腎細(xì)胞癌和胃腸間質(zhì)瘤的臨床前和臨床研究中均顯示出了確切的抗腫瘤效應(yīng)［5-6］。已有研究發(fā)現(xiàn)舒尼替尼在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、乳腺癌等其他實(shí)體腫瘤中顯示出明顯的抗腫瘤效應(yīng)［7-9］。然而在胰腺癌治療中的作用報(bào)道較少。

在本研究中，我們首先發(fā)現(xiàn)一定濃度的舒尼替尼對(duì)胰腺癌細(xì)胞具有一定的抑制增殖作用，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路在舒尼替尼誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞凋亡中的具有調(diào)節(jié)作用。Notch信號(hào)通路在維持細(xì)胞的自我更新、生長(zhǎng)、分化等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其在調(diào)控細(xì)胞的凋亡及腫瘤化療耐藥性中亦起著極為重要的作用。本研究將為開發(fā)新型胰腺癌治療藥物提供新思路和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 藥物 舒尼替尼購(gòu)自ChemicalBook（CB972 8174），溶于二甲基亞砜（DMSO，Solarbio生物技術(shù)有限公司），起始濃度為100 μmol/L，用細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋。

重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0?Flag?NICD由上海吉瑪生物制品公司合成；兔抗人Notch1抗體（C?20，SC?6014）購(gòu)自 Santa Cruz公司；兔抗人 Caspase?3，Caspase?8，Caspase?9抗體，HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 人胰腺癌細(xì)胞系Mia?Paca?2、Capan?1 購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心（ATCC），培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、1 μg/mL 鏈霉素的 1640（Gibco）培養(yǎng)基中。置于含有5%CO2和95%空氣的37℃恒溫培養(yǎng)箱。在25 cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)到約80%～90%，0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

Capan?1細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書，優(yōu)化體系后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞接種至塑料平皿中，控制細(xì)胞數(shù)量，使對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞生長(zhǎng)到所需密度（80%～90%）時(shí)轉(zhuǎn)染適量表達(dá)質(zhì)粒DNA。用一定量的雙無(wú)培養(yǎng)基（無(wú)血清、無(wú)抗生素的1640細(xì)胞培養(yǎng)液）稀釋DNA，輕輕震蕩混勻，靜置5 min。按1∶2的比例將Lipofectamine 2000用雙無(wú)1640細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋，輕輕震蕩混勻，靜置5 min。將稀釋的Lipo?fectamine 2000加到稀釋的DNA液中輕輕震蕩混勻，靜置20 min。用PBS洗滌細(xì)胞，給細(xì)胞培養(yǎng)皿中的細(xì)胞換上4 mL雙無(wú)1640培養(yǎng)基。將DNA和Lipofectamine 2000的混合液加入細(xì)胞中，繼續(xù)在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后，換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h。將培養(yǎng)液換成含不同濃度G418抗生素的培養(yǎng)基，抗生素濃度按梯度遞增（0、50、100、200、400、600、800和1 000 μg/mL）。持續(xù)培養(yǎng)10～14 d以800 μg/mL濃度進(jìn)行維持培養(yǎng)篩選穩(wěn)定表達(dá)克隆，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè)舒尼替尼對(duì)Mia?Paca?2、Capan?1細(xì)胞的增殖抑制作用 消化、收集1×104對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，每孔取100 μL接種于96孔板培養(yǎng)24 h，加入舒尼替尼終濃度分別為10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25 μmol/L 的 1640 培養(yǎng)基 150 μL/孔，對(duì)照孔只加入等量的培養(yǎng)基即可，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別作用24、48、72 h，整體實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。加入20 μL MTT（5 mg/mL，Sigma）在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h后，扣掉上清液，加入150 μL DMSO，在搖床上緩慢震蕩直至藍(lán)色結(jié)晶充分溶解。利用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞在490 nm波長(zhǎng)的吸光度（OD值）。公式：細(xì)胞增殖抑制率（%）=［1-（實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組）］×100%。計(jì)算50%細(xì)胞生長(zhǎng)抑制所需的藥物濃度（IC50）及不同濃度的舒尼替尼對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=5）表示。以藥物濃度對(duì)數(shù)值為X軸，OD值為Y軸作圖，從圖中求出半數(shù)抑制濃度（IC50）。

舒尼替尼對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.0?Flag?NICD細(xì)胞增殖的影響檢測(cè)方法同上。

1.4 細(xì)胞核染色法檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Capan?1細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化重懸后，以1×107個(gè)/L密度接種于預(yù)置蓋玻片的6孔板中，細(xì)胞貼壁后吸棄舊培養(yǎng)液，加入終濃度為1.0、0.5、0.25 μmol/L的舒尼替尼2 mL作用48 h后，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞3次，加入2 mL 4%多聚甲醛4℃固定15 min；PBS洗滌，5 min×3次，緩搖，加5 μg/mL DAPI避光染色2 min，避光條件下PBS洗滌，5 min×3次，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

舒尼替尼對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.0?Flag?NICD細(xì)胞凋亡的影響檢測(cè)方法同上。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡分析（Western Blot） 不同濃度舒尼替尼藥物作用細(xì)胞48 h，預(yù)冷PBS洗滌兩次，加入1×細(xì)胞裂解緩沖液（RIPA）100 μL，冰浴裂解細(xì)胞30 min，每10 min震蕩混勻一次，12 000 r/min、離心5 min，加入等體積的上樣緩沖液，100℃水浴5 min，儲(chǔ)存于-20℃冰箱。SDS?PAGE電泳后，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移凝膠中蛋白至PVDF膜上。5%脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜，TBST洗膜，加入兔抗人一抗（封閉液1∶200稀釋）4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜三次，加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗（按1∶5 000稀釋）室溫孵育1 h。等體積加入化學(xué)發(fā)光液（A、B液）進(jìn)行顯影，BioRad凝膠成像系統(tǒng)分析檢測(cè)，圖像經(jīng)Image J軟件分析測(cè)定蛋白豐度。

舒尼替尼對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.0?Flag?NICD細(xì)胞凋亡信號(hào)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響檢測(cè)方法同上。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3～6）表示。兩組之間進(jìn)行比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn)進(jìn)行，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度舒尼替尼對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用 終濃度為 10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25 μmol/L 舒尼替尼作用細(xì)胞 24、48、72 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)舒尼替尼對(duì) Mia?Paca?2、Capan?1 細(xì)胞生長(zhǎng)具有增殖抑制作用，抑制效果呈時(shí)間、濃度依賴性，與對(duì)照組進(jìn)行比較，不同時(shí)間和不同濃度舒尼替尼增殖抑制率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

當(dāng)細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.0?Flag?NICD，過(guò)表達(dá)Notch 1胞內(nèi)段，細(xì)胞增殖能力顯著提高，加入舒尼替尼不能有效抑制細(xì)胞增殖。見圖1。

2.2 不同濃度舒尼替尼誘導(dǎo)Capan?1細(xì)胞發(fā)生凋亡形態(tài)改變 終濃度為0.25、0.5、1.0 μmol/L舒尼替尼作用細(xì)胞株Capan?1 48 h后，同對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組隨著藥物濃度的增加凋亡細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、體積縮小或核碎裂的現(xiàn)象，出現(xiàn)較深的藍(lán)色熒光。且隨著藥物濃度的增加，處于凋亡晚期細(xì)胞明顯增多（圖2、3）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，舒尼替尼抑制細(xì)胞增殖可直接通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)。同樣濃度舒尼替尼作用穩(wěn)定表達(dá)pcD?NA3.0?Flag?NICD細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞凋亡顯著降低（P＜0.05）。

圖2 舒尼替尼誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變Fig.2 Morphological changes of the apoptosic pancreatic cancer cells induced by Sunitinib

圖3 舒尼替尼誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞Capan?1凋亡統(tǒng)計(jì)Fig.3 Calculation of capan?1 cell apoptosis induced by Sunitinib

2.3 舒尼替尼對(duì)Capan?1細(xì)胞凋亡信號(hào)通路及Notch?1表達(dá)的影響 0.25、0.5、1.0 μmol/L舒尼替尼作用Capan?1細(xì)胞48 h后，Notch?1蛋白的表達(dá)量隨藥物濃度的增加而降低（P＜0.05），同對(duì)照組相比，各濃度組舒尼替尼均能降低Notch?1蛋白的表達(dá)水平（P＜0.05）。同時(shí)，經(jīng)過(guò)舒尼替尼處理后，Capan?1 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白 Caspase?9、Caspase?8、Caspase?3隨藥物濃度的增加表達(dá)水平明顯增加，表明了這些凋亡相關(guān)蛋白參與了細(xì)胞凋亡的過(guò)程（圖4），實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。然而，舒尼替尼不能誘導(dǎo)過(guò)表達(dá)NICD細(xì)胞凋亡相關(guān)通路蛋白表達(dá)水平增高。

圖4 舒尼替尼對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Sunitinib on the expressions of apoptosic signaling pathway in pancreatic cancer cells

3 討論

胰腺癌被稱之為“癌中之王”，是目前預(yù)后非常差的腫瘤之一。具有起病隱匿、早期診斷困難、轉(zhuǎn)移早、化療耐受、臨床治療效果差、病死率高等特點(diǎn)，其1年生存率＜ 20%，5年生存率不足5%［10］。因此，尋找胰腺癌早期診斷分子標(biāo)記物，開發(fā)新型、高效、副作用小、靶向性強(qiáng)新藥迫在眉睫。近年來(lái)，隨著新藥研發(fā)和藥物臨床試驗(yàn)的開展，為晚期胰腺癌的治療帶來(lái)了新希望。舒尼替尼是一種口服的小分子多靶點(diǎn)酪氨酸酶抑制劑，已被用于治療腎癌和對(duì)伊馬替尼抵抗的胃腸道間質(zhì)瘤，臨床前研究發(fā)現(xiàn)舒尼替尼能夠明顯抑制非小細(xì)胞肺癌移植瘤模型，并且臨床研究均顯示在乳腺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤中也具有明顯的抗腫瘤效應(yīng)。

在本研究中，我們首先檢測(cè)舒尼替尼是否對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖具有抑制作用。MTT結(jié)果表明，不同濃度舒尼替尼對(duì)兩種胰腺癌細(xì)胞均有顯著的增殖抑制作用，而且抑制作用具有濃度和時(shí)間依賴性。但是其抑制作用的分子機(jī)制不清楚。有研究表明，Notch信號(hào)通路激活能抑制順鉑誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的凋亡［11］，同時(shí)，Notch通路在胰腺癌組織及細(xì)胞中表達(dá)增高、活性增強(qiáng)，提示說(shuō)明Notch通路可能在胰腺癌化療耐受中發(fā)揮一定的作用。馬永超等［12］研究表明Notch通路蛋白表達(dá)及活性受到酪氨酸激酶的調(diào)節(jié)，作為酪氨酸激酶抑制劑的舒尼替尼是否能通過(guò)抑制Notch通路的蛋白表達(dá)及活性，發(fā)揮抑制胰腺癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用，需要進(jìn)行深入研究。蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度舒尼替尼作用胰腺癌細(xì)胞48 h，Notch1蛋白表達(dá)水平顯著下降；同時(shí)，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白表達(dá)水平顯著增高，說(shuō)明Notch1通路可能參與舒尼替尼誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。當(dāng)胰腺癌細(xì)胞穩(wěn)定過(guò)表達(dá)NICD后，不同濃度舒尼替尼不能顯著抑制細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)凋亡，進(jìn)一步驗(yàn)證了我們的假設(shè)。該研究將為有效提高胰腺癌化療敏感性、減少化療耐受，改善胰腺癌患者預(yù)后提供積極的理論依據(jù)。