李城 李昌熙 王大新 戴燕 金世光

江蘇省蘇北人民醫(yī)院1疼痛科，2醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心（江蘇揚(yáng)州225001）

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，有術(shù)后致殘率高、復(fù)發(fā)率高、易出現(xiàn)侵襲轉(zhuǎn)移、難以與周?chē)M織分清界限、進(jìn)展迅速、癲癇發(fā)生率高等特點(diǎn)，對(duì)多種治療方案具有高耐受性［1-3］。惡性腫瘤患者中有15%～25%會(huì)發(fā)生腦轉(zhuǎn)移，其中未治療患者生存期僅為1個(gè)月左右［4-5］。miR?17?5p在肝癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌、肺癌等中的功能已經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道［6-10］，miR?17?5p在肝癌中通過(guò)激活MAPK信號(hào)通路促進(jìn)其增殖和遷移［6］，在宮頸癌中通過(guò)靶向TP53INP1抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡［7］，而其在膠質(zhì)瘤中的作用尚不清楚。因此，本課題就miR?17?5p對(duì)膠質(zhì)瘤的增殖遷移的作用機(jī)制，以及其是否通過(guò)參與P13K?AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性進(jìn)行研究。以期為今后惡性膠質(zhì)瘤放射治療聯(lián)合基因治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑 0.25%胰蛋白酶消化液，RNA酶，10%胎牛血清H?DMEM培養(yǎng)液，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87?2M1、SW1088，pSilencer2.1?U6 neo試劑盒（Ambion，美國(guó)）。

1.2 儀器 qRT?PCR儀（ABI StepOne Plus），流式細(xì)胞儀（MoFlo XDP），生物安全柜 1205A（FORMA），CO2培養(yǎng)箱（FORMA），倒置顯微鏡 IX70（OLYM?PUS）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 miRNA芯片技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)miR?17?5p在膠質(zhì)瘤中表達(dá) 針對(duì)3對(duì)同一患者來(lái)源的膠質(zhì)瘤組織及其鄰近的癌旁正常組織中的miRNA表達(dá)水平，用miRNA芯片技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 qRT?PCR檢測(cè)miR?17?5p在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá) 提取6株膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（U87?2M1、SW1088、U87、T98G、U251、U138）和1株正常星狀細(xì)胞（NHA）的總RNA，然后反轉(zhuǎn)加尾，利用qRT?PCR檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（U87?2M1、SW1088、U87、T98G、U251、U138）和正常星狀細(xì)胞（NHA）中miR?17?5p的表達(dá)水平。

1.3.3 qRT?PCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR?17?5p后膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR?17?5p的表達(dá) 向膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87?2M1中轉(zhuǎn)染miR?17?5p mimics 36～ 48 h后，利用qRT?PCR檢測(cè)miR?17?5p的表達(dá)水平。

1.3.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞克隆形成能力 向膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SW1088中分別轉(zhuǎn)染mimics Control，miR?17?5p mimics，ASO?NC，miR?17?5p?ASO（miRNA拮抗劑），36～48 h后進(jìn)行平板克隆形成實(shí)驗(yàn)，第14天結(jié)束，計(jì)數(shù)6孔板中形成克隆的數(shù)目，觀察miR?17?5p對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞克隆形成能力的影響。

1.3.5 Transwell檢測(cè)miR?17?5p影像膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87?2M1和SW1088中分別轉(zhuǎn)染 miR?17?5p mimics或miR?17?5p ASO，36 h后進(jìn)行transwell實(shí)驗(yàn)，計(jì)數(shù)通過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)平均值。

1.3.6 流式凋亡檢測(cè)miR?17?5p影像膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性 將膠質(zhì)瘤細(xì)胞SW1088分為6組，3組轉(zhuǎn)染mimics Control，3組轉(zhuǎn)染miR?17?5p mimics，轉(zhuǎn)染24 h后，分別將一組mimics control和一組miR?17?5p mimics用0、4、6 Gy的X線照射（源皮距為100 cm，劑量率為320 cGy/min，瓦里安600 C，加速器6 MV X線照射），每組的每個(gè)劑量點(diǎn)均重復(fù)3次，然后用Annexin V?PI雙染色法驗(yàn)證miR?17?5p對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放療增敏性的調(diào)節(jié)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因芯片結(jié)果顯示miR?17?5p在膠質(zhì)瘤中高表達(dá) 芯片結(jié)果顯示與相應(yīng)的癌旁正常組織相比，miR?17?5p在3個(gè)膠質(zhì)瘤組織樣本中表達(dá)水平相對(duì)比較高（P＜0.05），芯片結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 基因芯片檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織中miRNA的表達(dá)變化Fig.1 The miRNA expression differences observed in glioma cancer cells obtained by gene chip detection analysis

2.2 qRT?PCR檢測(cè)miR?17?5p在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá) 檢測(cè)結(jié)果表明，與正常星狀細(xì)胞（NHA）相比，miR?17?5p在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（U87?2M1、SW1088、U87、T98G）中高表達(dá)，其中膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87?2M1、SW1088表達(dá)量比較高，這與基因芯片結(jié)果一致，結(jié)果見(jiàn)圖2，其中用U6作為內(nèi)參。接下來(lái)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)采用膠質(zhì)瘤系U87?2M1、SW1088。

圖2 qRT?PCR檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和正常星狀細(xì)胞系中miR?17?5p的表達(dá)水平Fig.2 The expression level of miR?17?5p in glioma cancer cells and normal astrocytes analyzed by qRT?PCR

2.3 qRT?PCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR?17?5p后，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR?17?5p的表達(dá) 檢測(cè)結(jié)果表明，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞（U87?2M1）中過(guò)表達(dá)miR?17?5p后，miR?17?5p的表達(dá)水平升高，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 qRT?PCR檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR?17?5p的表達(dá)水平（U6作內(nèi)參）Fig.3 The expression level of miR?17?5p in glioma cancer cells assessed by qRT?PCR（U6 as control）

2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)表明miR?17?5p促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR?17?5p增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞SW1088的克隆形成能力，而轉(zhuǎn)染miR?17?5p?ASO將會(huì)降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞SW1088的克隆形成能力。結(jié)果如圖4所示，轉(zhuǎn)染后48 h檢測(cè)的不同表達(dá)水平的miR?17?5p對(duì)SW1088細(xì)胞集落形成能力的影響（P＜0.05）。

圖4 miR?17?5p對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SW1088集落形成能力的影響Fig.4 The effect of miR?17?5p on the colony formation of glioma cancer cells SW1088

2.5 Transwell表明miR?17?5p促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲 轉(zhuǎn)染miR?17?5p mimics后，細(xì)胞侵襲能力與對(duì)照組相比升高；轉(zhuǎn)染miR?17?5p ASO后，細(xì)胞侵襲能力與對(duì)照組相比降低，結(jié)果見(jiàn)圖5?？梢?jiàn)miR?17?5p可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87?2M1和SW1088的侵襲能力。

2.6 流式凋亡檢測(cè)表明miR?17?5p可以降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性 分析流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染mimics control組隨著X線照射劑量的增加（0、4、6 Gy），膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SW1088的細(xì)胞凋亡數(shù)目百分比依次增加，0 Gy的X射線照射時(shí)凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)是1.38%，4 Gy的X射線照射時(shí)凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)是14.25%，6 Gy的X射線照射時(shí)凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)是32.92%。而轉(zhuǎn)染miR?17?5p mimics組隨著X線照射劑量的增加（0、4、6 Gy），膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SW1088的細(xì)胞凋亡數(shù)目百分比也依次增加，0 Gy的X射線照射時(shí)凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)是0.78%，4 Gy的X射線照射時(shí)凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)是7.43%，6 Gy的X射線照射時(shí)凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)是17.34%。而相同劑量X射線照射時(shí)，轉(zhuǎn)染miR?17?5p組膠質(zhì)瘤細(xì)胞SW1088的凋亡細(xì)胞百分比顯著低于轉(zhuǎn)染mimics control組。這些結(jié)果表明miR?17?5p可以降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞SW1088對(duì)放療的敏感性。

圖5 miR?17?5p對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87?2M1和SW1088侵襲能力的影響Fig.5 The effect of miR?17?5p on the invasion and metastasis of U87?2M1 and Sw1088 glioma cancer cells

圖6 流式檢測(cè)miR?17?5p對(duì)放射敏感性的檢測(cè)Fig.6 The FACS analysis of radio?sensitivity of miR?17?5

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的惡性腫瘤，占全部顱內(nèi)腫瘤的40%～50%［11］，膠質(zhì)瘤臨床治療的難點(diǎn)主要是由于其臨床表現(xiàn)和癥狀、影像學(xué)或形態(tài)學(xué)預(yù)警及其浸潤(rùn)性沒(méi)有顯著的特征［12-13］。目前越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道，miRNAs參與細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞分化等多種生物學(xué)行為［14］，同時(shí)也可參與惡性腫瘤的侵襲、遷移、腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)以及腫瘤干細(xì)胞的調(diào)控等［15-18］。

本實(shí)驗(yàn)利用miRNA芯片技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)miR?17?5p在膠質(zhì)瘤組織樣本中表達(dá)水平相對(duì)比較高，筆者預(yù)測(cè)miR?17?5p與膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)。因此，為了進(jìn)一步驗(yàn)證設(shè)想進(jìn)行了qRT?PCR檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（U87?2M1、SW1088、U87、T98G、U251、U138）和正常星狀細(xì)胞（NHA）中miR?17?5p的表達(dá)水平。結(jié)果表明膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87?2M1、SW1088中的miR?17?5p的表達(dá)水平明顯增高。qRT?PCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR?17?5p后，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR?17?5p的表達(dá)水平升高。通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)可以看出miR?17?5p具有增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移作用，反之降低生長(zhǎng)和遷移能力。同時(shí)，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)了miR?17?5p對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中放療敏感性的作用，結(jié)果顯示miR?17?5p可以降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞SW1088對(duì)放療的增敏性調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)探討證實(shí)了以下兩個(gè)個(gè)方面的科學(xué)問(wèn)題：（1）證實(shí)miR?17?5p促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移；（2）確立miR?17?5p與膠質(zhì)瘤對(duì)放療敏感性之間的關(guān)系。miRNA發(fā)揮作用存在一定的復(fù)雜性，同一種miRNA可能同時(shí)影響多個(gè)靶mRNA，而同一種靶mRNA也可能同時(shí)被多個(gè)miRNA靶定。因此，在分析這些靶基因時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)單一靶基因在體外分析時(shí)作用相對(duì)明顯，但是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)效果并不理想等特點(diǎn)。此時(shí)可以考慮多個(gè)基因聯(lián)合作用并詳細(xì)分析在體內(nèi)情況下，是哪些因素起主導(dǎo)作用，同時(shí)考慮體內(nèi)其他miRNA作用的代償作用，從而客觀分析miR?17?5p調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖遷移和放療敏感性的具體分子機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明miR?17?5p在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的角色，同時(shí)與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放療敏感性有關(guān)。但具體分子機(jī)制尚不明確，在下一步工作中需深入探討膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的信號(hào)通路，確定miR?17?5p作用的直接靶基因，明確miR?17?5p在信號(hào)通路中的作用機(jī)制。