文│伍佰鑫 何芳 浣成 段洪峰（湖南省畜牧獸醫(yī)研究所）

朱彥群 張永紅（湖南金健乳業(yè)有限責(zé)任公司）

乳房炎是由幾種細(xì)菌及其毒素引起的乳腺炎癥，是奶牛最常見(jiàn)的疾病之一。患畜產(chǎn)奶量減少、牛奶質(zhì)量改變，未到使用年限就不得不被淘汰，給奶牛養(yǎng)殖者造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。隱性乳房炎會(huì)負(fù)面影響到牛奶質(zhì)量（牛奶中含有炎癥要素和細(xì)菌）；減少的奶量會(huì)占到總損失奶量的2/3；患畜會(huì)成為其他奶牛感染隱性乳房炎的傳染源。目前，主要通過(guò)體細(xì)胞數(shù)（SCC）分析的方式篩查乳房?jī)?nèi)感染，健康奶牛乳中SCC較少；如果SCC（大量）增加，就暗示有隱性乳房炎。但是，SCC受很多因素影響，如年齡、泌乳天數(shù)、季節(jié)、應(yīng)激、飼養(yǎng)管理和日復(fù)一日的變化。因此，SCC并不總是與乳房感染有關(guān)。

病原微生物進(jìn)入乳池就開始增殖，誘導(dǎo)先天性免疫系統(tǒng)抵抗入侵者，伴隨牛奶中的SCC和乳頭管上皮細(xì)胞數(shù)增加，接著是細(xì)胞因子（小分子多肽）的合成上調(diào)。這些細(xì)胞因子誘導(dǎo)血管內(nèi)皮黏附分子表達(dá)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞（體細(xì)胞）跨內(nèi)皮細(xì)胞向感染部位遷移。其中一些細(xì)胞因子誘導(dǎo)急性期反應(yīng)，表現(xiàn)為發(fā)燒、白細(xì)胞動(dòng)員、促進(jìn)急性期蛋白質(zhì)（APP）的產(chǎn)生。

反芻動(dòng)物主要的APPs是血清淀粉樣蛋白A（SAA）和結(jié)合珠蛋白（Hp）。機(jī)體組織損傷后（24小時(shí)），血漿和（或）其他體液中的SAA濃度迅速而強(qiáng)烈地增加（1000倍），使得這種蛋白作為非特異性的炎癥標(biāo)記物具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。牛奶中的這種蛋白水平是奶牛乳房炎感染的敏感指標(biāo)。

埃及的哈尼·艾哈邁德·侯賽因（Hany Ahmed Hussein）等學(xué)者，通過(guò)對(duì)68頭（每頭4個(gè)乳區(qū)）處于泌乳中期的奶牛采集272份奶樣、檢測(cè)奶樣中的SCC和MAA（乳淀粉樣蛋白A）濃度、分離培養(yǎng)出344個(gè)細(xì)菌菌株，發(fā)現(xiàn)了引起乳房炎的主要病原體，即鏈球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌。同時(shí)，比較了SCC與MAA檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性。

一、研究方法

對(duì)68頭（每頭4個(gè)乳區(qū)）處于泌乳中期的黑白花奶牛，采集272份奶樣，每份奶樣15毫升。采樣前，用濃度為70%的酒精消毒乳頭，前3次擠出的奶不采集。采樣后，將樣本裝入消毒管，置于冰塊上，轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行SCC和細(xì)菌檢測(cè)。奶樣在-18℃條件下保存，直至MAA分析結(jié)束。272份奶樣中，220份（80.88%）來(lái)自臨床診斷為健康的奶牛；52份（19.12%）來(lái)自臨床診斷為有乳房炎癥狀的奶牛：擠奶有痛感、乳房腫脹、產(chǎn)奶量減少、牛奶質(zhì)量明顯改變（微黃色、有塊狀物）。

運(yùn)用基于熒光圖像分析技術(shù)的NucleoCounter體細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)奶樣中的SCC，測(cè)定范圍為1萬(wàn)～200萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升。所有奶樣都取10微升樣品，37℃培養(yǎng)于血瓊脂基質(zhì)、麥康基瓊脂、馬-欣二氏瓊脂（波蘭）和愛(ài)德華茲培養(yǎng)基（英國(guó)），分別培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)。通過(guò)革蘭氏染色記錄菌落形態(tài)，運(yùn)用API檢驗(yàn)（波蘭）對(duì)分離的細(xì)菌進(jìn)行詳細(xì)鑒定。

根據(jù)SCC和細(xì)菌檢測(cè)，將奶樣分為7個(gè)組：G1-菌檢（-）、SCC≤50萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升；G2-菌檢（-）、SCC＞50萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升；G3-菌檢（+）、SCC≤20萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升；G4-菌檢（+）、20萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升＜SCC＜50萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升；G5-菌檢（+）、50萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升＜SCC≤100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升；G6-菌檢（+）、100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升＜SCC≤200萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升；G7-菌檢（+）、SCC＞200萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升。運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定套件（ELISA，愛(ài)爾蘭）并根據(jù)說(shuō)明書，測(cè)定上述5個(gè)陽(yáng)性組奶樣的MAA濃度。主要測(cè)定過(guò)程是將牛奶和生物素化單克隆SAA抗體培養(yǎng)在微滴板孔內(nèi)，牛奶中的MAA被黏結(jié)成像三明治的標(biāo)記物；沖洗移除未黏結(jié)物之后，在酶底物（四甲基聯(lián)苯胺）加入之前，將剩余物和鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶一起培養(yǎng)在微滴板孔內(nèi)；加入酶底物之后停止反應(yīng)。運(yùn)用自動(dòng)平板閱讀器（美國(guó)），在450納米處測(cè)定微滴板孔內(nèi)的光密度；通過(guò)繪制MAA濃度與光密度的關(guān)系曲線，確定樣品中未知的MAA濃度。樣品先按1∶50稀釋，然后一式兩份載入。

二、研究結(jié)果

272份奶樣中，68份（25%）菌檢為陰性、204份（75%）菌檢為陽(yáng)性。204份中，96份只受單一病原體感染，占總奶樣數(shù)（272份）的35.3%；108份受多種病原體感染，占總奶樣數(shù)（272份）的39.7%。從272份奶樣中分離出344個(gè)細(xì)菌菌株，其中，鏈球菌132個(gè)（占總奶樣數(shù)的48.53%）、大腸桿菌100個(gè)（占總奶樣數(shù)的36.76%）、金黃色葡萄球菌80個(gè)（占總奶樣數(shù)的29.41%）、凝固酶陰性葡萄球菌32個(gè)（占總奶樣數(shù)的11.76%）。

有乳房炎臨床癥狀奶牛的52份奶樣中，40份（76.92%）菌檢為陽(yáng)性、12份（23.08%）菌檢為陰性。沒(méi)有乳房炎臨床癥狀奶牛的220份奶樣中，148份（67.27%）的SCC≤50萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升，但其中100份菌檢為陽(yáng)性，可能是感染初期，中性粒細(xì)胞還沒(méi)有完全在感染部位云集；其余的72份（占32.73%）SCC＞50萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升，但其中8份菌檢為陰性，可能有其他病原體（霉菌或支原體）感染而沒(méi)有被檢測(cè)出來(lái)。

7個(gè)組奶樣（G1～G7）的MAA濃度分別是3.58毫克/升、35.20毫克/升、13.01毫克/升、28.07毫克/升、31.23毫克/升、39.35毫克/升、37.22毫克/升，MAA與SCC有很強(qiáng)的相關(guān)性。特別是G3組（SCC≤20萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升、菌檢為陽(yáng)性）的MAA約是G1組（SCC≤50萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升、菌檢為陰性）MAA的4倍，表明受細(xì)菌感染后，MAA有顯著變化。相對(duì)于隱性乳房炎的其他診斷指標(biāo)來(lái)說(shuō)，MAA的優(yōu)勢(shì)是：健康動(dòng)物乳中MAA的含量極少，無(wú)法被檢測(cè)到；除乳房炎外，MAA不受其他因素影響，能在保存的樣品中被檢測(cè)到。因此，牛奶中的MAA濃度是比檢測(cè)SCC更有用的診斷指標(biāo)，可監(jiān)控奶牛的乳房健康。

三、啟迪和討論

有乳房炎臨床癥狀奶牛的52份奶樣中，40份（76.92%）菌檢為陽(yáng)性、12份（23.08%）菌檢為陰性；說(shuō)明臨床診斷有乳房炎的多數(shù)（76.92%）確實(shí)有乳房炎，少數(shù)（23.08%）實(shí)際上沒(méi)有乳房炎，也就是說(shuō)，根據(jù)表面現(xiàn)象診斷并不是100%準(zhǔn)確。這52份奶樣占總奶樣數(shù)（272份）的19.12%，再根據(jù)總奶樣數(shù)中有204份（75%）菌檢為陽(yáng)性，可判斷出臨床診斷不出的隱性乳房炎占55.88%（=75%-19.12%）；也就是說(shuō)，半數(shù)以上的乳區(qū)看起來(lái)健康，實(shí)際上是亞健康。

沒(méi)有乳房炎臨床癥狀奶牛的220份奶樣中，148份（67.27%）的SCC≤50萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升，據(jù)此判斷無(wú)隱性乳房炎；實(shí)際上只有54.55%{=（220-100）÷220}的奶樣菌檢為陰性（的確無(wú)隱性乳房炎），說(shuō)明單純依靠SCC判斷無(wú)隱性乳房炎的誤差是12.72%（=67.27%-54.55%）。其余72份（32.73%）的SCC＞50萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升，據(jù)此判斷有隱性乳房炎；實(shí)際上只有29.09%{=（72-8）÷220}的奶樣有隱性乳房炎，說(shuō)明單純依靠SCC判斷有隱性乳房炎的誤差是3.64%（=32.73%-29.09%）。由此看來(lái)，根據(jù)SCC＞50萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升判斷有隱性乳房炎的準(zhǔn)確度（誤差?。?，高于根據(jù)SCC≤50萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升判斷無(wú)隱性乳房炎的準(zhǔn)確度（誤差大）。

用MAA檢測(cè)隱性乳房炎奶樣很可能更加準(zhǔn)確，但檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜，亮點(diǎn)是展示了在奶樣上做文章的創(chuàng)新思維。目前，國(guó)內(nèi)主要根據(jù)SCC預(yù)警隱性乳房炎奶樣（奶牛），多數(shù)運(yùn)用丹麥福斯集團(tuán)公司FossomaticTM FC體細(xì)胞儀，檢測(cè)過(guò)程方便快捷。但一般情況下，如果沒(méi)有額外進(jìn)行菌檢和細(xì)菌培養(yǎng)，則不能肯定地說(shuō)SCC為多少時(shí)就一定（沒(méi)）有隱性乳房炎。

總而言之，在生鮮牛奶的生產(chǎn)上，需要快速而準(zhǔn)確地識(shí)別出有隱性乳房炎的奶牛并及早防治，減少經(jīng)濟(jì)損失，保證牛奶質(zhì)量。因此，國(guó)內(nèi)儀器設(shè)備生產(chǎn)廠家應(yīng)結(jié)合MAA、SCC和菌檢研制出“中國(guó)制造”的隱性乳房炎檢測(cè)儀器，在21世紀(jì)人工智能時(shí)代，助力中國(guó)科技走在世界前列。