賈 浩，孫吉康，王 平，周 韜，吳 艷

（中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410004）

單面針，又名蚌殼花椒、山枇杷、大葉花椒、鐵桿椒等[1-2]，蕓香科木質(zhì)藤本，生長于山地林中，學(xué)名峴殼花椒，是一種重要的藥用植物，富含生物堿、香豆素、三萜類、黃酮、甾體類、酰胺、苯丙素類等植物有效活性成分，主要治療腰酸、牙痛、女性經(jīng)量過多和產(chǎn)后月經(jīng)不調(diào)等癥狀?，F(xiàn)階段關(guān)于單面針?biāo)幉牡难芯慷鄶?shù)停留在資源分布及生境調(diào)查[4-5]、化學(xué)成分的含量測定及分離[6-8]及對單面針人工快繁技術(shù)的研究[9-13]，對根、莖、葉的化學(xué)成分差異以及代謝物合成的生理生化機(jī)制鮮有報道。

代謝組學(xué)（Metabolomics/Metabonomics）其目的在于對某一生物或細(xì)胞在一特定生理時期內(nèi)所有低分子量（分子質(zhì)量＜1 000）代謝產(chǎn)物進(jìn)行成分及其動態(tài)變化的研究[14-15]。代謝物與生物的表型最為接近，被稱為基因與表型之間的橋梁[16]。代謝組學(xué)分析可以指示細(xì)胞、組織或器官的生化狀態(tài)，揭示生物各代謝網(wǎng)絡(luò)間的關(guān)聯(lián)性。目前，植物代謝組學(xué)主要采用4種分析技術(shù)，核磁共振譜（Nuclear magnetic resonance，NMR）、毛細(xì)管電泳色譜質(zhì)譜聯(lián)用（Capillary electrophoresis-mass spectrometry，CE-MS）、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用 （Gaschromatography-mass spectrometry，GC-MS） 和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用 （Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）。不同方法檢測的代謝物極性和類別不同，因此都不能完全覆蓋整個代謝組的化合物，但是鑒定的代謝物有部分重疊[17]。近年來，研究人員也正嘗試整合不同的分析技術(shù)，以期望能將各種優(yōu)勢結(jié)合起來，以彌補(bǔ)單一技術(shù)分析的不足。最先與代謝組學(xué)相關(guān)的文章是利用氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）技術(shù)來分析尿液和組織的提取物的代謝[18]。由于GC-MS的靈敏度高、分辨率高、重現(xiàn)性好、成本相對較低和具有大量的標(biāo)準(zhǔn)代謝物譜圖庫的優(yōu)勢，很適合對低極性、低沸點(diǎn)、相對分子質(zhì)量小或衍生化后能揮發(fā)的物質(zhì)進(jìn)行分析，也成為當(dāng)前植物代謝組學(xué)研究的一個主要分析技術(shù)之一。本研究將根、莖與葉的HPLC圖譜比對分析以了解根、莖、葉在成分上的總體差異，并采用GC-MS對根與葉進(jìn)行代謝組學(xué)比較分析以深入了解根與葉在有效成分上的差異，同時結(jié)合KEGG通路了解可能的代謝物合成途徑，為單面針?biāo)幱觅Y源的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

UV-2450紫外分光光度計（日本SHIMADZU）；Thermo臺式高速冷凍離心機(jī)；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（BRANSON Digital Sonifier）；AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；Aquapro超純水儀（AWJ1-2002-UT）；DFY-01萬能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有效公司）。Agilent氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890A-5975C）。

單面針?biāo)幉牟勺詮埣医缡凶唏R坪地區(qū)，經(jīng)中南林業(yè)科技大學(xué)喻勛林教授鑒定為蕓香科花椒屬單面針Zanthoxylum dissitum Hemsl 4年生可藥用植株。

2 方 法

2.1 樣本分組、提取分離

將單面針樣本葉設(shè)為A組，根設(shè)為B組。實(shí)驗分別編號為A1～A10，B1～B10，即每組10個平行。精密稱取植物60 mg于1.5 mL的離心管中，隨后加入40 μL內(nèi)標(biāo)（L-2-氯-苯丙氨酸，0.3 mg/mL。甲醇配置）和360 μL冷甲醇后勻漿（Tissuelyser-48中研磨，60 HZ，2 min）；勻漿液使用超聲波提取30 min后加入200 μL氯仿和400 μL H2O，再次在超聲波下提取30 min，低溫條件下離心10 min（14 000 rpm/min，4 ℃），將離心后所得上清液取700 μL裝入玻璃衍生瓶中，用快速離心濃縮儀揮干后在往其中加入80 μL甲氧胺鹽酸吡啶溶液（15 mg/mL），用渦旋震蕩儀震蕩2 min，轉(zhuǎn)移至37 ℃的震蕩培養(yǎng)箱中肟化反應(yīng)90 min，反應(yīng)后取出，往其中加入20 μL正己烷和80 μL衍生試劑BSTFA（含1%TMCS），用渦旋震蕩儀震蕩2 min后于70℃條件下反應(yīng)60 min。取出樣本，在室溫條件下放置30 min，進(jìn)行GC/MS代謝組學(xué)分析。

2.2 GC/MS及數(shù)據(jù)分析

取衍生化的提取物1 μL，采用GC-MS系統(tǒng)的無分流模式進(jìn)行分析。樣品在經(jīng)過與db- 5ms毛細(xì)管柱（30 m × 250 μm I.D., J&W Scientific, Folsom,CA）分離之后再進(jìn)入質(zhì)譜分析。分析包括GC /MS的樣本信息、質(zhì)量譜響應(yīng)強(qiáng)度和保留時間-質(zhì)量核比。對于樣本本質(zhì)譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度采用峰面積歸一化法來進(jìn)行規(guī)格化，得到歸一化的數(shù)據(jù)矩陣，再使用無監(jiān)督主成分分析（PCA）來觀察各個樣本之間的總體分布情況及整個分析過程的穩(wěn)定性。

2.3 差異代謝物的篩選及鑒定

采用單維分析（t檢驗）和多維分析（O）PLS-DA變量權(quán)重值相結(jié)合的方法對與組間的差異代謝物（VIP＞1，P＜0.05）進(jìn)行篩選。并將每個化合物的特征離子片段譜（Fragmentation patterns）的豐度與碎片質(zhì)荷比同F(xiàn)eihn代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫、NIST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，完成差異代謝物的鑒定，并將最終比對結(jié)果的匹配度超過70%的檢測物認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。通過使用MBRole（http://csbg.cnb.csic.es/mbrole/）網(wǎng)站的ID轉(zhuǎn)換功能和MBRole通路分析功能，利用已知的根與葉的差異代謝物，獲得差異代謝物的KEGG的物質(zhì) ID，再利用差異代謝物的KEGG ID進(jìn)行KEGG通路的顯著富集（P＜0.05）分析。

3 結(jié) 果

3.1 單面針?biāo)幉母?、葉代謝物組間差異分析

比較GC/MS的樣品信息、保留時間-質(zhì)核比和質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度，使用峰面積歸一化法對樣本質(zhì)譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行歸一化。將歸一化后的數(shù)據(jù)，進(jìn)行降維處理，以消除多信息共存中的重疊部分而提取出主要成分進(jìn)行分析。采用正交偏最小二乘法判別（OPLS-DA）分析，使A、B組間得到最大程度的分離，并有效降低組內(nèi)平行樣本的差異，結(jié)果見圖1。可見A、B組平行樣本均明顯分開，表明根與葉的代謝物具有明顯的差異。

3.2 篩選鑒定根、葉間差異代謝物并進(jìn)行KEGG通路富集分析

采用2.3方法篩選鑒定差異代謝物并利用MBRole網(wǎng)站進(jìn)行KEGG化合物匹配以及KEGG通路富集分析?；诖x物峰面積進(jìn)行A、B組樣本t 檢驗，得到峰面積具有顯著差異的差異代謝物，其中與KEGG化合物匹配的有77個（表1）。將這77個代謝物基于代謝物信息數(shù)據(jù)庫（KEGG）進(jìn)行KEGG通路富集分析（表2）。

圖1 單面針葉(A組)、根(B組)的OPLS-DA圖Fig. 1 OPLS-DA of leaves(A group) and roots (group B) of Zanthoxylum dissitum Hemsl

表1 經(jīng)鑒定的單面根與葉的差異代謝物Table 1 Identified metabolites of different content between roots and leaves

分析表2數(shù)據(jù)，可見差異代謝物主要富集于苯丙酸類的生物合成途徑（map01061）、類黃酮合成途徑（map 00941、map01061）、谷胱甘肽合成途徑（map 00480）、三羧酸循環(huán)途徑（map 00020）、β-丙氨酸代謝途徑（map 00410）、莽草酸途徑合成生物堿（map 01063）。本研究對苯丙素類生物合成途徑（map01061，圖2）和莽草酸途徑合成生物堿（map 01063，圖3）進(jìn)行了分析，并將代謝物在根、葉中的不同含量按照如下規(guī)律在圖中標(biāo)注顏色（根中含量更高的代謝物為紅色，葉中含量更高的代謝物為藍(lán)色，含量無顯著差異的代謝物為綠色）。

圖2 苯丙素類的生物合成途徑(map01061)Fig. 2 Biosynthesis of phenylpropanoids(map01061)

表2 單面針根與葉間差異代謝物富集的KEGG通路Table 2 Enriched KEGG pathway of metabolites of different content between roots and leaves

苯丙素類的生物合成途徑（圖3）顯示在葉中三羧酸循環(huán)代謝的重要中間代謝物檸檬酸，異檸檬酸、酮戊二酸含量都顯著高于根中，而且在葉中谷胱甘肽含量也顯著高于根，表明葉中的谷胱甘肽合成途徑以及三羧酸循環(huán)代謝途徑的活躍度高于根。

本研究表明:根與葉中生物堿類或類黃酮物質(zhì)的合成各有偏重，但從已鑒定的差異代謝物的種類及其功能看，具有抗菌、抗炎成分的代謝物在根和葉中雖都有存在，但主要存在于根中，在葉中存在很少；具有清除自由基、抗氧化功能的代謝物主要存在于葉中。如苯丙素類的生物合成途徑（map01061，圖2）中，屬于香豆素類（coumarin）的莨菪亭（scopoletin）、苯丙素類（phenylpropanoids）的阿魏酸（ferulate）、類黃酮（flavonoids）的二氫槲皮素（dihydroquercetin）根中含量均高于葉中。莨菪亭有祛風(fēng)、抗炎、止痛、祛痰作用；阿魏酸有抗凝血、抗炎作用；二氫槲皮素則對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、痢疾桿菌和傷寒桿菌有較強(qiáng)的抑菌作用。而兒茶素（catechin），柚皮素（Naringenin）在葉中含量更高。柚皮素既具有抗菌、抗炎的功能，也具有清除自由基、抗氧化等活性，兒茶素是茶葉的重要成分，有清除自由基、抗氧化等功能。

莽草酸途徑合成生物堿（map 01063，圖3）中，以苯丙氨酸（phenylalanine）為前體合成的香蘭素（vanillin）、酪胺(tyramine)在根中含量較高。左旋多巴(l-dopa)、N-甲基氨基苯甲酸（Methylanthranilic acid）在葉中含量更高。香蘭素具有鎮(zhèn)靜及抗癲癇作用；酪胺具有收縮子宮、收縮末梢神經(jīng)及升高血壓的生理作用；左旋多巴經(jīng)多巴脫羧酶脫羧而轉(zhuǎn)變成多巴胺發(fā)揮作用，同時也是異喹啉類物質(zhì)的前體物質(zhì)；N-甲基氨基苯甲酸多作為鄰氨基苯甲酸母核生物堿的前體，是吖啶堿或喹啉類物質(zhì)的前體物質(zhì)。

圖3 莽草酸途徑合成生物堿(map 01063)Fig. 3 Biosynthesis of alkaloids derived from shikimate pathway(map 01063)

4 討論與結(jié)論

花椒屬植物是傳統(tǒng)的食用、藥用植物，含有多種植物有效成分，主要包括揮發(fā)油、生物堿、酰胺、香豆素、木質(zhì)素、脂肪酸等，具有多種藥理功效，如抑菌抗病毒作用、驅(qū)蟲殺蟲作用、對鎮(zhèn)痛抗炎、抗?jié)?、止癢等作用[19]。隨著研究技術(shù)及研究方法的不斷進(jìn)步，以及代謝組學(xué)方法的不斷革新，花椒屬各個屬的果實(shí)、種子、根、莖以及葉片的各個部位的生理活性物質(zhì)都逐漸被人們所探知，其藥理學(xué)功能也不斷被認(rèn)知，因此花椒屬植物的藥品開發(fā)將具有巨大的潛力和深遠(yuǎn)的意義[20]。

馬英姿等[2]從單面針的根中提取的中性親脂性成分具有良好的抑菌作用，并從單面針中性親脂性成分中分離得到2種香豆素:佛手內(nèi)酯和異虎耳草素屬于香豆素類。香豆素是一類具有多種生物活性如抗凝血、抗HIV、抗癌、抗真菌等作用的小分子化合物[21-22]。比較莨菪亭與異虎耳草素和佛手內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)（圖4），發(fā)現(xiàn)具有極為相似的內(nèi)核結(jié)構(gòu)，顯示單面針中有多種香豆素類物質(zhì)作為重要的有效成分。

圖4 佛手內(nèi)酯、異虎耳草素和莨菪亭的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 4 The chemical ctructure bergapten, isopimpinellin and scopoletin

肖燦等[23-24]對單面針莖中有效成分進(jìn)行分離得到兩面針堿、血根堿、花椒棚堿。韋瑀龍等[25]在單面針種鑒定出花椒堿、大葉桉亭、茵芋堿、香豆酰酪胺、橙黃胡椒酰胺5個生物堿。肖燦等[23]、韋瑀龍等[25]、袁園[26]、馬英姿等[27]都鑒定出了白蘚堿。這些生物堿主要屬于喹啉類生物堿。與生物堿生物合成有關(guān)的主要氨基酸有鳥氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、鄰氨基苯甲酸、組氨酸等。單面針代謝組差異代謝物富集的通路中主要有苯丙氨酸-酪氨酸母核類型生物堿（如本研究鑒定的莨菪亭、阿魏酸、香蘭素、酪胺），鄰氨基苯甲酸母核生物堿（如本研究鑒定的N-甲基氨基苯甲酸）兩類生物堿的合成。苯丙氨酸-酪氨酸母核類型生物堿有苯丙胺類、芐基苯乙胺類、異喹啉類、吐根堿等類型；鄰氨基苯甲酸母核生物堿有喹啉類、吖啶酮類、喹唑啉等類型。

本研究氣相色譜-質(zhì)譜法測定的代謝組數(shù)據(jù)，反應(yīng)了單面針早期次生代謝物的生成情況，揭示了在單面針的根莖部、葉片中存在較大的成分差異。如葉中的谷胱甘肽合成高于根，而且三羧酸循環(huán)的中間代謝物如檸檬酸，異檸檬酸、酮戊二酸含量更高，這些中間代謝物可以作為合成其他分子的碳鏈骨架，顯示葉中的生物合成代謝更為活躍。另外，根或葉都有生物堿類或類黃酮物質(zhì)的合成。但是從已經(jīng)鑒定的具體物質(zhì)看，具有抗菌、抗炎的生物堿、類黃酮物質(zhì)在根中含量更高些；而葉中含量更高的代謝物多具有清除自由基、抗氧化等功能。而這一結(jié)論與王麗美等[28]對不同部位的單面針?biāo)幉腍PLC圖譜研究的結(jié)論相吻合，這為我們進(jìn)一步研究單面針有效藥用成分及其生物合成提供了參考。本研究闡述了單面針的根莖及葉的成分差異，但對其成分的分析仍然停留在基礎(chǔ)性的研究上，對具有生物活性成分的及其中的構(gòu)效關(guān)系并不明朗，有待進(jìn)一步的探索研究。