俞冰倩,楊 賽,朱 琳,高 鳳,曾椿淋,柳參奎,崔恒林,魏 巍* (.江蘇大學(xué)農(nóng)業(yè)裝備工程學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江0；.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 0；.東北林業(yè)大學(xué),鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心,黑龍江 哈爾濱50040)

鹽堿土是陸地上分布廣泛的一種土壤類型.我國鹽堿土面積大,類型多樣,主要分布在我國華北、東北和西北的內(nèi)陸干旱、半干旱地區(qū),以及東部沿海的濱海地區(qū),是我國重要的后備耕地資源[1].根據(jù)鹽堿土中土壤陰離子的不同(如HCO3-、CO32-、SO42、Cl-等),我國主要分布的鹽堿土類型包括富含氯化物的濱海鹽堿地、含有氯化物和硫酸鹽的華北泛濫平原鹽堿地、富含硫酸鹽(2～10倍于氯化物)的西北內(nèi)陸荒漠鹽堿地,以及富含碳酸根/重碳酸根的東北草原鹽堿地等[2].這些不同類型的鹽堿地土壤多為極端的高鹽高堿環(huán)境,雖不適宜動、植物的生存,但卻棲息著大量的耐鹽堿、甚至嗜鹽堿的微生物類群[3].這些微生物的生命活動在改變鹽堿地土壤理化性質(zhì)的同時,也受到其極端理化性質(zhì)的影響,從而可能形成適應(yīng)高鹽堿環(huán)境的,與一般微生物不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、遺傳特性和生理功能[4].而上述可用來劃分鹽堿土類型的土壤陰離子的含量和種類,很可能是影響土壤微生物群落分布的重要環(huán)境因子.因此,我國分布的具有不同陰離子類型的鹽堿土是潛在的天然微生物資源寶庫.

古細(xì)菌是一類區(qū)別于細(xì)菌的原核微生物,其獨特的基因類型和生理特點使其具有適應(yīng)、甚至改變高鹽高堿環(huán)境的能力[5].同時其代謝產(chǎn)物多具有開發(fā)利用的潛力.例如嗜鹽古菌產(chǎn)生的生物多聚物胞外多糖(EPS)能夠應(yīng)用在食品、藥品等眾多行業(yè)[6];嗜鹽古菌產(chǎn)生的胞外蛋白酶可應(yīng)用于高鹽發(fā)酵工業(yè)、洗滌和污水處理等[7].因此,對我國不同地區(qū)分布的不同陰離子類型的鹽堿土進(jìn)行古細(xì)菌群落多樣性的研究,既可以為揭示不同鹽堿土生態(tài)效應(yīng)提供重要依據(jù),也可以為耐鹽或嗜鹽古細(xì)菌資源的開發(fā)提供重要參考.然而,目前研究土壤古細(xì)菌群落的培養(yǎng)法和免培養(yǎng)法均具有一定的局限性[8].培養(yǎng)法的工作量大耗時長,以及受到培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的限制,無法獲得土壤中微生物的種群結(jié)構(gòu)[9].PLFA[10]、PCR- DGGE[11]和 16S rRNA克隆文庫[12]等免培養(yǎng)方法仍難以確定微生物群落全貌,無法全面地揭示微生物群落的多樣性[13].而新一代基于 Illumina平臺的高通量測序技術(shù)的出現(xiàn),可以更全面、更準(zhǔn)確地解析環(huán)境中微生物群落多樣性的特征,為解析我國不同地區(qū)分布的不同陰離子類型的鹽堿土土壤中古細(xì)菌群落多樣性提供了有力手段[14].

近幾年,我國鹽堿土微生物群落特征的解析研究逐漸受到人們的關(guān)注[15,29,41].如李新等[16]基于高通量測序研究了內(nèi)蒙古河套灌區(qū)3種不同鹽堿程度鹽堿土的細(xì)菌群落,結(jié)果表明變形菌門(Proteobacteria)是主要的細(xì)菌類群.李海云等[17]研究了原生鹽堿土、次生鹽堿土和農(nóng)田土中的放線菌群落結(jié)構(gòu)特征,研究結(jié)果展現(xiàn)了鹽堿土壤中蘊(yùn)藏著豐富的放線菌資源,原生鹽堿土的放線菌種群豐富度最高,次生鹽堿土次之,農(nóng)田土最低.但對于古細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征的解析研究尚未廣泛開展,因此我國不同地域鹽堿土壤古細(xì)菌群落分布尚不明確.而上述劃分我國不同地域鹽堿土類型的不同土壤陰離子種類和濃度,很可能成為鹽堿土微生物群落演替的關(guān)鍵因素.因此,本研究通過采集我國黑龍江安達(dá)蘇打鹽堿土(東北草原鹽堿地)、新疆達(dá)坂城鹽堿土(內(nèi)陸荒漠鹽堿地)、山西運城鹽堿土(華北平原鹽堿地)、江蘇東臺海濱鹽堿土(濱海鹽堿地)和天津濱海新區(qū)鹽堿土(濱海鹽堿地)等 5個分布于不同地域和氣候條件的鹽堿土土壤,基于高通量測序技術(shù)對其古細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行了深度解析,并通過與鹽堿土壤陰離子類型和含量特征的關(guān)聯(lián)分析,明確鹽堿土土壤陰離子對土壤古細(xì)菌群落特征形成的影響,為進(jìn)一步揭示我國不同類型鹽堿土壤古細(xì)菌群落的生態(tài)功能提供參考.同時,為我國不同類型鹽堿土壤微生物資源的開發(fā)利用提供指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 鹽堿土壤樣品的采集

采樣地位于我國黑龍江安達(dá)蘇打鹽堿地(HA)、新疆達(dá)坂城荒漠鹽堿地(XD)、山西運城平原鹽堿地(SY)、江蘇東臺濱海鹽堿地(JD)和天津濱海鹽堿地(TB).采樣時間為2015年5月.采用五點取樣法,在各采樣地區(qū)選取無植被覆蓋的裸露鹽堿土(避免植物根系分泌物對古細(xì)菌群落的影響),用土鉆取土壤表層0～20cm 的土樣,然后將五個樣點采集的土樣均勻混合.采集好的土壤置于冰盒中,盡快發(fā)送回實驗室.將土壤分成 2份,-80℃條件下保存一份供分子生物學(xué)研究,一部分土樣風(fēng)干過篩后用于不同理化指標(biāo)的測定.

1.2 土壤理化性質(zhì)的測定

對五個不同類型鹽堿土樣進(jìn)行 pH以及重碳酸根離子(HCO3-)、碳酸根離子(CO32-)、氯離子(Cl-)和硫酸根離子(SO42-)四種陰離子含量的測定.稱取10.0g風(fēng)干過2mm篩的土壤,置于50mL燒杯中,加入25mL水,密封后振蕩5min,靜置2h,用梅特勒-托利多公司的FE28pH計測定pH值.土壤中和的含量采用雙指示劑–中和滴定法[18]. Cl-和 SO42-的含量采用離子色譜法測定.儀器為瑞士萬通 883basic IC plus離子色譜儀,淋洗液是碳酸鈉體系.稱取氯化鈉1.649g,硫酸鈉1.478g溶于小燒杯中,轉(zhuǎn)移至1L容量瓶中,定容至刻度,搖勻,配成濃度均為1000mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,將其稀釋成不同濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[19].稱取風(fēng)干土樣 2.5g(精確到 0.001g)于 50mL離心管中,加入 25mL超純水,塞緊瓶塞,在 25℃恒溫振蕩器上振蕩16h,在4000r/min下離心15min,取上清液,用 0.22μm 的濾膜過濾,將樣品稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛冗M(jìn)行檢測.

1.3 樣品的DNA提取

分別從充分混合的樣品中取0.5g土壤提取微生物基因組DNA.應(yīng)用日本和光公司的DNA提取試劑盒Isoil beads beating,按照操作說明進(jìn)行微生物基因組總DNA的提取.提取后的總DNA應(yīng)用Nanodrop one進(jìn)行濃度的測定.

1.4 PCR擴(kuò)增及高通量測序

本試驗采用古細(xì)菌16SrRNA的V4區(qū)域作為目標(biāo)DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR擴(kuò)增以古細(xì)菌16S rRNA的 V4可變區(qū)設(shè)計的古細(xì)菌通用引物NU519F(GTGYCAGCMGCCGCGGTAA)和N806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT),并各自添加不同的Barcode序列后對5個不同類型鹽堿土樣中古細(xì)菌16S rRNA的 V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增.PCR擴(kuò)增均采用Takara試劑公司的 HS Taq酶進(jìn)行,反映條件均為95℃預(yù)變性5min;95℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸 40s,25個循環(huán); 72℃延伸 10min[20].擴(kuò)增結(jié)束后,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用 1%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳,檢查擴(kuò)增效果.將PCR產(chǎn)物送至北京諾禾致源科技有限公司Illumina-Hiseq平臺上進(jìn)行高通量測序.

1.5 數(shù)據(jù)分析處理

5個樣品高通量測序獲得的原始DNA序列數(shù)量在51927-69762之間(表2).對原始序列數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制,以獲得更為精準(zhǔn)、高質(zhì)量的 DNA序列信息.采用Mothur軟件將得到的16S rRNA基因序列在Silvar數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行嵌合體檢驗,充分去除嵌合體序列.為了得到每個 OTU對應(yīng)的物種分類信息,采用貝葉斯算法對 97%相似水平的操作分類單元(OTU)代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析,并在各個水平上統(tǒng)計每個樣品的群落組成,利用 Mothur軟件構(gòu)建稀釋性曲線[21-22].用QIME軟件計算樣品 Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)[23-24].其中Chao1指數(shù)描述群落豐富度,其值越高表明群落物種的豐富度越高;Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)可以反映樣品的多樣性程度,其值越大表明樣品群落多樣性越高.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽堿土樣品理化性質(zhì)分析

鹽堿土樣品的理化性質(zhì)如表1所示.5個土壤樣品的pH值為7.6～9.5,pH值由高到低依次為黑龍江蘇打鹽堿土(HA)、山西平原鹽堿土(SY)、天津濱海鹽堿土(TB)、新疆荒漠鹽堿土(XD)、江蘇濱海鹽堿土(JD).HCO3-主要存在于黑龍江蘇打鹽堿土(HA)中,含量為 4.66cmol/kg,在其他土樣中含量均很少.CO32-只存在于黑龍江蘇打鹽堿土(HA)中,含量為 2.87cmol/kg.5個土樣中均含有Cl-(含量為0.2～89.8cmol/kg)和SO42-(含量為0.1～62.2cmol/kg),且不同樣品間均有很大差異.江蘇濱海鹽堿土(JD)和天津濱海鹽堿土(TB)樣品具有較高的 Cl-濃度,新疆荒漠鹽堿土(XD)樣品中具有最高的 SO42-濃度,黑龍江蘇打鹽堿土(HA)樣品中 Cl-和 SO42-的含量均為最低,山西平原鹽堿土(SY)樣品中同時具有較高的Cl-和 SO42-濃度,且濃度值較為相近.由此可見,不同地域的鹽堿土具有不同的pH值及土壤陰離子特征.

表1 五種鹽堿土壤樣品的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of five kinds of saline-alkali soil samples

2.2 不同鹽堿土壤古細(xì)菌群落豐富度與多樣性

通過對黑龍江蘇打鹽堿土(HA)、新疆荒漠鹽堿土(XD)、山西平原鹽堿土(SY)、江蘇濱海鹽堿土(JD)、天津濱海鹽堿土(TB)五種不同類型鹽堿土壤古細(xì)菌 16S rRNA序列片段測序.得到的原始序列經(jīng)去除低質(zhì)量、Barcode和引物序列后,5個樣品分別得到 59,740、62,073、47,950、52,282、46,494條有效序列,經(jīng)過 RDP數(shù)據(jù)庫的注釋以及 OTU分析后,分別獲得 580、604、516、489、536個古細(xì)菌OTU(表2).所有土壤樣品中古細(xì)菌16S rRNA測序文庫覆蓋率均超過99.5%(表2),說明更深的測序幾乎不會產(chǎn)生更多的OTU種類,該五個土壤的測序文庫已經(jīng)達(dá)到飽和.根據(jù)古細(xì)菌 16S rRNA測序的稀釋性曲線(圖1A),當(dāng)測序量超過40000條時,整個曲線已經(jīng)趨于平緩,同樣說明該測序文庫已經(jīng)達(dá)到飽和.

表2 五種鹽堿土壤古細(xì)菌群落高通量測序文庫質(zhì)量匯總Table 2 Information of high-throughput DNA sequencing library of five kinds of saline-alkali soil samples

圖1 五種鹽堿土壤古細(xì)菌群落高通量測序文庫稀釋曲線(A)及OTU維恩圖(B)Fig.1 Rarefaction curve of high-throughput DNA Sequencing library(A) and Venn diagram of archaeal community (B)in five kinds of saline-alkali soils

從表2中可以看出,新疆荒漠鹽堿土(XD)和黑龍江蘇打鹽堿土(HA)的古細(xì)菌群落OTU數(shù)量和Chao1指數(shù)均高于其他土壤樣品,說明新疆荒漠鹽堿土(XD)和黑龍江蘇打鹽堿土(HA)中土壤古細(xì)菌群落具有最高的豐富度,即新疆荒漠鹽堿土(XD)和黑龍江蘇打鹽堿土(HA)中古細(xì)菌物種數(shù)量高于其他土壤樣品.通過比較五種鹽堿土壤古細(xì)菌群落的 Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)可以發(fā)現(xiàn),黑龍江蘇打鹽堿土(HA)和新疆荒漠鹽堿土(XD)的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)是五個土壤樣品中最低的,黑龍江蘇打鹽堿土(HA)和新疆荒漠鹽堿土(XD)的古細(xì)菌群落多樣性低且分布不均勻.由此可見,雖然黑龍江蘇打鹽堿土(HA)和新疆荒漠鹽堿土(XD)土壤中古細(xì)菌群落具有較高的物種數(shù)量,但是群落多樣性和均勻度差.該結(jié)果表明兩個內(nèi)陸鹽堿土壤中古細(xì)菌群落中的優(yōu)勢種群具有明顯的優(yōu)勢性.

維恩圖可以直觀地表現(xiàn) 5種不同類型鹽堿土壤古細(xì)菌群落的OTU數(shù)目組成相似性、重疊情況以及特異性(圖 1B).五種鹽堿土壤之間存在共有古細(xì)菌OTU數(shù)量為 193,占總 OTU數(shù)量的 7%.其中130個OTU(67%)分布在五個樣品土壤古細(xì)菌群落的優(yōu)勢古細(xì)菌群落中,99個古細(xì)菌 OTU屬于廣古菌門(Euryarchaeota),31個古細(xì)菌 OTU屬于奇古菌門(Thaumarchaeota).黑龍江蘇打鹽堿土(HA)、山西平原鹽堿土(SY)、新疆荒漠鹽堿土(XD)、天津濱海鹽堿土(TB)、江蘇濱海鹽堿土(JD)鹽堿土壤中特異性古細(xì)菌OTU數(shù)量分別為169、56、54、39、16,其中黑龍江蘇打鹽堿土(HA)的特異性古細(xì)菌 OTU數(shù)量最多,是特異性古細(xì)菌 OTU數(shù)量最少的江蘇濱海鹽堿地(JD)的 10.6 倍.

2.3 五種鹽堿土壤古細(xì)菌群落組成

應(yīng)用Unifrac方法將所有處理古細(xì)菌OTU進(jìn)行加權(quán)的聚類分析,即在考慮 OTU序列的數(shù)量和進(jìn)化關(guān)系的基礎(chǔ)上,計算各個樣品間的聚類關(guān)系,五個鹽堿土壤樣品中古細(xì)菌群落在門分類水平上的分布比例見圖 2.五個樣品中古細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成情況相似,但各類古細(xì)菌類群所占比例均有差異.通過聚類樹可以看出五個不同鹽堿土壤樣品間的相似性,樣品越靠近,枝長越短,說明 2個樣品的物種組成越相似,五個樣品中黑龍江安達(dá)蘇打鹽堿土(HA)與其他土壤樣品差異較大.所有樣品中古細(xì)菌優(yōu)勢群落主要隸屬于廣古菌門(Euryarchaeota)和奇古菌門(Thaumarchaeota)(比例大于總測序量的1%).廣古菌門在新疆荒漠鹽堿土(XD)、山西平原鹽堿土(SY)、江蘇濱海鹽堿土(JD)、天津濱海鹽堿土(TB)中占主要優(yōu)勢,所占相對豐度分別為 52.9%、67.8%、79.2%和 63.3%,而在黑龍江蘇打鹽堿土(HA)中較少(3.0%).奇古菌門(Thaumarchaeota)在黑龍江蘇打鹽堿土(HA)中占主要優(yōu)勢,所占比例為 72.7%.在其余鹽堿土中依次為11%(SY)、8.8%(TB)、8.6%(XD)和 2.8%(JD).

圖2 五種鹽堿土壤古細(xì)菌在門分類水平群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Archaeal community composition at phylum level in five kinds of saline-alkali soils

五個鹽堿土壤樣品中古細(xì)菌群落在屬分類水平的分布情況見圖 3.五個樣品中古細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成和主要優(yōu)勢屬(Top 10)所占比例均有較大差異.其中黑龍江蘇打鹽堿土(HA)中占優(yōu)勢的古細(xì)菌菌屬和相對豐度分別為 Nitrososphaera (62.3%)和Cenarchaeum(餐古菌屬,9.8%).新疆荒漠鹽堿土(XD)中占優(yōu)勢的古細(xì)菌菌屬分別為 Haloterrigena(鹽陸生菌屬,20.2%)、Cenarchaeum (餐古菌屬,8.2%)、Halanaeroarchaeum(4.9%)、Halorubrum(鹽紅菌屬,3.8%)和 Natronomonas(嗜鹽堿單孢菌屬,1.3%).山西平原鹽堿土(SY)中占優(yōu)勢的古細(xì)菌菌屬分別為Cenarchaeum(10.2%)、Natronomonas(嗜鹽堿單孢菌屬,8.1%)、Halogranum(7.5%)、Haloplanus(鹽盤菌屬,5.2%)、Halanaeroarchaeum(2.9%)和 Halorubrum(鹽紅菌屬,1.6%).江蘇東臺濱海鹽堿土(JD)中占優(yōu)勢的古細(xì)菌菌屬分別為Halorubrum(鹽紅菌屬, 24.4%)、Natronomonas(嗜鹽堿單孢菌屬,9.2%)、Natronobacterium(嗜鹽堿桿菌屬,5.1%)、Halobellus(4.9%)、Halanaeroarchaeum(4.3%)、Haloterrigena(鹽陸生菌屬,3.1%)、Haloplanus(鹽盤菌屬,3.0%)和Cenarchaeum(餐古菌屬,2.6%).天津濱海濱海鹽堿土(TB)中占優(yōu)勢的古細(xì)菌菌屬分別為Halorubrum(鹽紅菌屬,15.6%)、Cenarchaeum (餐古菌屬,8.5%)、Halanaeroarchaeum (5.2%)、Haloplanus(鹽盤菌屬,4.2%)、Natronomonas(嗜鹽堿單孢菌屬,3.6%)和Halobellus(1.8%).除主要優(yōu)勢屬(Top 10)外,5個鹽堿土壤樣品中還分別注釋到 29個屬(HA,總相對豐度1.2%)、34個屬(XD,總相對豐度8.0%)、32個屬(SY,總相對豐度10.7%)、29個屬(JD,總相對豐度9.5%)、33個屬(TB,總相對豐度 8.2%).此外,5個鹽堿土壤樣品中分別有 26.7%(HA)、53.6%(XD)、53.8%(SY)、33.8%(JD)和52.9%(TB)的OTU序列無法利用數(shù)據(jù)庫注釋出物種類型,說明5個鹽堿土壤中棲息著大量未知的古細(xì)菌類群.

圖3 五種鹽堿土壤古細(xì)菌的Top 10菌屬相對豐度Fig.3 The relative abundance of the Top 10archaeal in five kinds of saline-alkali soils

根據(jù)五個不同鹽堿地在屬水平的物種注釋及豐度信息,選取豐度排名前 35的古細(xì)菌屬及其在每個樣品中的豐度信息繪制熱圖,并從分類信息和樣品間差異兩個層面進(jìn)行聚類(圖4).在Top 35的古細(xì)菌屬中,只有Cenarchaeum、Nitrososphaera屬于奇古菌門(Thaumarchaeota),其余均屬于廣古菌門(Euryarchaeota)且其中絕大部分為嗜鹽古菌.五個土壤樣品中古細(xì)菌群落分布各有差異,都有各自特有的古細(xì)菌. Halalkalicoccus和Nitrososphaera 2個屬主要分布于黑龍江蘇打鹽堿土(HA);Halolamina、Haloterrigena、Methanohalophilus、Halovivax 和Natronorubrum 5個屬主要分布于新疆荒漠鹽堿土(XD);Salinarchaeum、Halarcgaeum、Halosimplex、Halohasta、Salinirubrum、Halogranu和Halomicroarcula 7個屬主要分布于山西平原鹽堿土(SY);Halorubrum、Halobellus、Halapricum、Halobaculum、Halomicrobium、Natronoarchaeum、Halogeometricum、Halopenitus和Natronobacterium9個屬主要分布于江蘇濱海鹽堿土(JD);Halorubellus、Haloarcula、Halonotius、Haloarchaeobius、Halorhabdus、Halopelagius和Haladaptatus7個屬主要分布于天津濱海鹽堿土(TB).

圖4 五種鹽堿土壤樣品Top 35的古細(xì)菌屬相對豐度及聚類分布熱Fig.4 The heatmap of archaeal genus at Top 35level from five kinds of saline-alkali soil samples

2.5 五種鹽堿土壤古細(xì)菌群落構(gòu)成與鹽堿環(huán)境理化特性相關(guān)分析

典范對應(yīng)分析(CCA)是一種非線性多元直接梯度分析方法,它把對應(yīng)分析與多元回歸結(jié)合起來,由于每一步的計算結(jié)果都將微生物群落數(shù)據(jù)與環(huán)境因子進(jìn)行回歸,因此 CCA排序能夠很好地反應(yīng)古細(xì)菌群落在特征因子梯度上的分布[25].將5個樣品的古細(xì)菌群落、相對豐度大于5%的優(yōu)勢古細(xì)菌菌屬與土壤樣品的pH以及所含的HCO3-/CO32-、Cl-、SO42-離子進(jìn)行CCA分析(圖5).CCA1和CCA2的特征值分別是52.22%和24.8%,說明這幾個因子能夠很好地解釋古細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化.圖中分布的散點可以看出微生物群落結(jié)構(gòu)分布,箭頭越長說明,說明這個因素對微生物群落結(jié)構(gòu)影響越大.

5個鹽堿地樣品的CCA分析顯示其分為明顯的3個區(qū)域.黑龍江蘇打鹽堿土(HA)古細(xì)菌群落,尤其是優(yōu)勢菌屬Nitrososphaera與土壤HCO3-/CO32-含量和pH呈現(xiàn)出明顯的相關(guān)性,說明HCO3-/CO32-和 pH 對黑龍江蘇打鹽堿土(HA)古細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的形成具有較大影響,且 Nitrososphaera屬較適合生存于 pH及HCO3-/CO32-含量較高的鹽堿土環(huán)境.江蘇濱海鹽堿土(JD)、山西平原鹽堿土(SY)和天津濱海鹽堿土(TB)古細(xì)菌群落CCA距離較近,說明這3個地區(qū)的古細(xì)菌群落較為相似,尤其是優(yōu)勢菌屬 Halorubrum、Natronomonas、Halogranum、Haloplanus和Natronobacterium與土壤較高的Cl-含量相關(guān),說明Cl-對這三個地區(qū)古細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的形成具有較大影響.且上述5個古細(xì)菌屬較適合生存在Cl-含量高的鹽堿土環(huán)境.新疆荒漠鹽堿土(XD)的古細(xì)菌群落,尤其是Haloterrigena和Halanaeroarchaeum兩個屬與SO42-具有較高的相關(guān)性,說明SO42-對新疆荒漠鹽堿土(XD)中古細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的形成具有較大影響,且Haloterrigena和Halanaeroarchaeum兩個屬較適宜生存于SO42-含量高的鹽堿土環(huán)境.從圖5中還可以看出,在 5個鹽堿地樣品中均存在的奇古菌門的Cenarchaeum不受土壤pH及陰離子的影響.由此可見,我國不同地區(qū)不同陰離子類型的鹽堿土土壤中古細(xì)菌群落的分布與鹽堿土中HCO3-/ CO32-、Cl-、SO42-的含量有密切的關(guān)系.

圖5 五個樣品中古細(xì)菌群落與環(huán)境因子的相關(guān)性Fig.5 Correlation between the archaeal community and environmental factors in five samples

3 討論

3.1 鹽堿土古細(xì)菌群落對不同土壤陰離子類型的響應(yīng)

通過對我國五種不同地區(qū)鹽堿土土壤陰離子類型和含量的檢測,發(fā)現(xiàn)黑龍江蘇打鹽堿土(HA)以重碳酸根離子(HCO3-)和碳酸根離子(CO32-)為主要土壤陰離子且pH最高、新疆荒漠鹽堿土(XD)以硫酸根離子(SO42-)為主要土壤陰離子、山西平原鹽堿土(SY)以氯離子(Cl-)和硫酸根離子(SO42-)為主要土壤陰離子、江蘇濱海鹽堿土(JD)和天津濱海鹽堿土(TB)均以氯離子(Cl-)為主要土壤陰離子且天津濱海鹽堿土(TB)中Cl-最高,這符合各地區(qū)鹽堿土土壤主要陰離子的分布特征.通過對五個土壤樣品中古細(xì)菌群落 16S rRNA 基因片段進(jìn)行高通量測序研究,結(jié)果表明,新疆荒漠鹽堿土(XD)和黑龍江蘇打鹽堿土(HA)中土壤古細(xì)菌群落具有最高的豐富度,但多樣性和均勻度差,說明古細(xì)菌中優(yōu)勢種群優(yōu)勢明顯,山西平原鹽堿土(SY)土壤古細(xì)菌群落多樣性最高且均勻度最好.在五個土壤樣品中古細(xì)菌包括廣古菌門、奇古菌門、泉古菌門,優(yōu)勢群落主要隸屬于廣古菌門和奇古菌門.其中廣古菌門在新疆荒漠鹽堿土(XD)、山西平原鹽堿土(SY)、江蘇濱海鹽堿土(JD)、天津濱海鹽堿土(TB)中均為最優(yōu)勢菌群,而奇古菌門在黑龍江安達(dá)蘇打鹽堿土(HA)中為最優(yōu)勢菌群.在五個土壤中檢測到的泉古菌門的豐度很少,這可能與土壤本身性質(zhì)及其中包含的其他微生物不適宜泉古菌門生長有關(guān),且泉古菌是一類大多為依賴硫的超極端微生物,在海洋中分布比較廣泛[26].黑龍江蘇打鹽堿土(HA)中古細(xì)菌與其他不同地區(qū)分布的不同土壤陰離子類型的鹽堿土差異最大,可能是受土壤陰離子(HCO3-/CO32-)和pH的影響.新疆荒漠鹽堿土(XD)中古細(xì)菌主要受 SO42-影響,而山西平原鹽堿土(SY)、江蘇濱海鹽堿土(JD)和天津鹽堿土(TB)主要受Cl-影響.

在五個土壤樣品中發(fā)現(xiàn)的43個古細(xì)菌屬中有37個屬于廣古菌門的嗜鹽菌綱(Halobacteria),其中除東北黑土外,均為優(yōu)勢.五個土壤樣品古細(xì)菌群落中嗜鹽菌綱(Halobacteria)豐度由高到低依次為江蘇東臺濱海鹽堿土(JD)(79%)、山西運城平原鹽堿土(SY)(68%)、天津濱海鹽堿土(TB)(63%)、新疆達(dá)坂城荒漠鹽堿土(XD)(51%)、黑龍江安達(dá)蘇打鹽堿土(HA)(2%).傳統(tǒng)意義上屬于古菌域、廣古菌門的嗜鹽古菌綱的全部物種都是嗜鹽古菌[27].嗜鹽古菌的許多蛋白質(zhì)在低鹽環(huán)境中不起作用,因而是一類需要生長在高鹽環(huán)境中的古菌,其驅(qū)動著鹽環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)的生物地球化學(xué)循環(huán)[28].目前,嗜鹽古菌大多是從海洋、鹽(堿)湖、曬鹽場、鹽堿土壤和人工鹽制品等高鹽環(huán)境中分離得到的[23].此外,五個土壤樣品發(fā)現(xiàn)的廣古菌門下與甲烷反應(yīng)有關(guān)的古菌含量很少,可能由于甲烷反應(yīng)需要厭氧條件,而供試樣品是0～20cm的表層土壤[30].

黑龍江鹽堿土中以奇古菌門為主要優(yōu)勢類群.該古菌菌門在海洋、淡水、土壤和沉積物中都有大量分布.其中最廣為人知的是氮素地球化學(xué)循環(huán)過程中發(fā)揮重要轉(zhuǎn)換作用的氨氧化古菌(Ammoniaoxidizing archaea,AOA)[31].AOA可以將環(huán)境中的氨離子氧化為亞硝酸鹽,是硝化作用的第一步驟[32].2005年K?nneke等[33]從海洋沉積物中分離了一株屬于化能自養(yǎng)型的溫泉古菌 Nitrosopumilus maritimus SCM1,能夠以 NH4+作為唯一能源,通過將 NH4+氧化成為 NO2-而獲得生長,這是首次在實驗室條件下獲得氨氧化古菌純培養(yǎng)菌株.目前已知的 AOA類群包括 group I.1a、group I.1b、ThAOA 和 group I.aassociated[34].在大多數(shù)水生和陸地生態(tài)系統(tǒng)中,AOA的amoA基因數(shù)量及表達(dá)量普遍高于AOB的amoA基因數(shù)量[35],AOA豐度高及高效的基因表達(dá)說明AOA對土壤生態(tài)系統(tǒng)的氮循環(huán)可能起著非常重要的作用.本研究中黑龍江鹽堿土 HA中富含的奇古菌門主要屬于Nitrososphaera.Nitrososphaera是一類以重碳酸鹽為碳源、利用銨態(tài)氮氧化產(chǎn)生細(xì)胞能量進(jìn)行化能無機(jī)自養(yǎng)生長的微生物.我們的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)在五個土壤樣品中Nitrososphaera為主的AOA主要存在于黑龍江安達(dá)蘇打鹽堿土(HA)中,這可能與HA中重碳酸鹽和碳酸鹽含量最高相關(guān).該結(jié)果也說明古菌主導(dǎo)的硝化作用可能是黑龍江蘇打鹽堿土中微生物所決定的重要的一種生物地球化學(xué)循環(huán)過程.

3.2 高通量測序在土壤微生物中的應(yīng)用

近年來,以一代測序技術(shù)為基礎(chǔ)的一些分子生態(tài)學(xué)技術(shù),例如 PCR-DGGE技術(shù)和克隆文庫技術(shù),是普遍使用的土壤微生物研究方法.申衛(wèi)收等[36]使用PCR-DGGE法分別對綽墩山古代和現(xiàn)代水稻田土層及過渡層之間的古菌群落進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)水稻的種類和耕作條件對古菌群落結(jié)構(gòu)的改變有一定程度的影響.孟祥偉等[37]利用克隆文庫技術(shù)分析了西藏米拉山土壤古菌16S rRNA及amoA基因多樣性,發(fā)現(xiàn)西藏米拉山高寒草甸土壤中古菌多樣性比較豐富,優(yōu)勢菌群和獲得的氨氧化古菌都屬于泉古菌門.然而,隨著高通量測序技術(shù)的出現(xiàn),徹底改變了微生物群落多樣性的研究方法.高通量技術(shù)可以檢測到低豐度的微生物,更能展現(xiàn)出群落結(jié)構(gòu)豐富的多樣性,而且速度快,結(jié)果準(zhǔn)確[38-39].因此,高通量測序技術(shù)逐漸成為目前分子生態(tài)學(xué)研究中應(yīng)用最普遍的新一代測序技術(shù),且已經(jīng)被應(yīng)用到鹽堿土微生物群落多樣性研究領(lǐng)域.夏圍圍等[40]通過高通量測序和DGGE技術(shù)對新西蘭典型草地和森林土壤的微生物群落的組成、豐度和多樣性進(jìn)行分析,結(jié)果表明高通量測序能夠較為全面和準(zhǔn)確的反映土壤微生物群落結(jié)構(gòu),而DGGE僅能夠反映有限的優(yōu)勢微生物類群,在很大程度上極可能低估土壤微生物的物種組成并高估其豐度.牛世全等[41]應(yīng)用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)分析河西走廊地區(qū)鹽堿土壤(原生鹽堿土、次生鹽堿土、農(nóng)田土)微生物多樣性,發(fā)現(xiàn)該地區(qū)鹽堿土壤中微生物多樣性非常豐富,存在大量的微生物類群,次生鹽堿土與農(nóng)田土微生物群落差異較小且多樣性最高.本研究將基于 Illumina平臺的高通量測序技術(shù)應(yīng)用于鹽堿土古細(xì)菌的研究,相較于傳統(tǒng)的純培養(yǎng)和以 16S rRNA為基礎(chǔ)的非培養(yǎng)方法,該技術(shù)可以檢測到以往沒有檢測到的、可能扮演著重要角色的低豐度(相對豐度小于 1%)土壤古細(xì)菌菌屬,為更準(zhǔn)確地認(rèn)識和開發(fā)極端環(huán)境中古細(xì)菌資源提供了重要的參考.

4 結(jié)論

4.1 采自我國不同地區(qū)的5個鹽堿土樣品具有不同比例含量的HCO3-、CO32-、Cl-和 SO42-等 4 種土壤陰離子,且可以此為依據(jù)劃分成不同的鹽堿土類型.

4.2 供試的五種鹽堿土壤古細(xì)菌優(yōu)勢群落主要集中于廣古菌門和奇古菌門.不同樣品間古細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成和主要優(yōu)勢屬所占比例均有較大差異.黑龍江蘇打鹽堿土以奇古菌門的 Nitrososphaeria綱為主,其余土壤樣品以廣古菌的嗜鹽古菌綱為主.

4.3 黑龍江蘇打鹽堿地、新疆荒漠鹽堿地、山西平原鹽堿地、江蘇濱海鹽堿地和天津濱海鹽堿地中最優(yōu)勢的古細(xì)菌菌屬分別為 Nitrososphaera (62.3%)、Haloterrigena (20.2%), Cenarchaeum (10.2%),Halorubrum (24.4%)和Halorubrum (15.6%).

4.4 供試鹽堿土土壤的不同陰離子類型可能驅(qū)動了鹽堿土壤古細(xì)菌群落的分布和結(jié)構(gòu)多樣性.