曾 鵬,郭朝暉,肖細(xì)元,彭 馳,黃 博,辛立慶 (中南大學(xué),冶金與環(huán)境學(xué)院環(huán)境工程研究所,湖南 長(zhǎng)沙 410083)

植物修復(fù)具有環(huán)境友好、成本低、美化環(huán)境、不易引起二次污染等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛利用[1].目前植物修復(fù)重金屬污染土壤的研究主要集中在東南景天(Sedum alfredii H.)[2]、龍葵(Solanum nigrum L.)[3]等超富集植物和海桐(Pittosporum tobira)[4]、珊瑚樹(Viburnum odoratissinum)[5]、泡桐(Paulownia fortunei)[6]、柳樹(Salix)[7]等耐性植物.木本植物具有生物量大,生長(zhǎng)周期長(zhǎng),較大的綠色空間和發(fā)達(dá)的根系,可廣泛用于重金屬污染土壤的生態(tài)復(fù)墾[8].然而利用植物修復(fù)污染土壤的最終目標(biāo)不僅是清除或減少土壤中的重金屬等污染物,而且要求恢復(fù)污染土壤的生物學(xué)特性.有研究表明,重金屬對(duì)土壤酶和微生物活性的抑制作用明顯[9-11].但植物可有效降低污染土壤中重金屬對(duì)土壤酶活性和微生物的不利影響[12].耐性植物白玉草(Silene vulgaris)可恢復(fù)重金屬污染土壤的β-半乳糖苷酶活性,在根際細(xì)菌群落中出現(xiàn)了新的物種[13].種植玉米(Zea mays L.)有利于降低 Cd和Pb對(duì)土壤脲酶和脫氫酶的抑制作用,并提高土壤基因多態(tài)性和基因豐富度[14].因此,植物在修復(fù)和改善重金屬污染土壤生態(tài)環(huán)境質(zhì)量上扮演重要的角色.

構(gòu)樹(Broussonetia papyrifera)屬于?？茦?gòu)屬的落葉喬木,具有速生、適應(yīng)性強(qiáng)、分布廣、易繁殖等特點(diǎn),適于重金屬污染礦區(qū)生長(zhǎng),是礦區(qū)植被恢復(fù)的先鋒樹種[15].有研究表明,每株構(gòu)樹一年可移除Zn和Cu的總量可達(dá) 32.5和 6.67mg[16],且構(gòu)樹對(duì)多種重金屬都有較強(qiáng)的富集與轉(zhuǎn)移能力,其綜合生物濃縮指數(shù)可達(dá) 2.93[17].總之,構(gòu)樹在修復(fù)重金屬污染土壤方面具有巨大應(yīng)用前景.然而構(gòu)樹在修復(fù)重金屬污染土壤過程中對(duì)污染土壤環(huán)境質(zhì)量的影響還不是很清楚.因此,本文通過溫室盆栽試驗(yàn),研究構(gòu)樹在修復(fù)重金屬污染土壤過程中對(duì)土壤酶活性和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響,以期為構(gòu)樹大規(guī)模生態(tài)修復(fù)重金屬污染土壤提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試土壤和植物

溫室盆栽土壤采自湖南省某典型冶煉區(qū)0～20cm的表層土壤,土壤基本理化性質(zhì)如表1所示.收集的土壤風(fēng)干過 5mm 篩后用于盆栽試驗(yàn).供試植物構(gòu)樹苗采自野外生長(zhǎng)的構(gòu)樹幼苗.

表1 供試土壤基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physiochemical properties of tested soil

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將過5mm篩的土壤混合均勻后裝入長(zhǎng)33cm,寬22cm,高 19cm 的塑料盆中.每盆裝入土壤 10kg.每盆加入2.7g CO(NH2)2,0.5g NH4H2PO4,1.6g KNO3作為基肥.基肥以70%的田間持水量加入土壤中,平衡30d后,統(tǒng)一移栽大小一致的構(gòu)樹幼苗.每盆 3次重復(fù).試驗(yàn)期間,光照周期為10h/d,溫室內(nèi)晝夜溫度為30/20,℃根據(jù)盆栽土壤水分狀況澆灌去離子水,以保持盆栽土壤濕潤(rùn).構(gòu)樹修復(fù)和未修復(fù)(對(duì)照)的土壤在60,90,150,210和270d后進(jìn)行動(dòng)態(tài)取樣.采取5點(diǎn)取樣法取出適量土壤,一部分用于土壤重金屬有效態(tài)含量測(cè)定,一部分用于土壤酶活性測(cè)定和土壤 DNA的提取.分別動(dòng)態(tài)收獲修復(fù)90,150,210和270d后的構(gòu)樹植株.將每次收獲的構(gòu)樹植株按根、莖、葉分開,依次用自來水和去離子水清洗干凈后,105℃殺青30min后,在60℃下烘干至恒重,稱重,粉碎備用.

1.3 測(cè)試與分析

土壤基本性質(zhì)的分析根據(jù)魯如坤[18]的方法:土壤pH值采用Mettler Toledo 420 pH計(jì)測(cè)定(水土比為2.5:1);土壤有機(jī)質(zhì)含量采用低溫外熱重鉻酸鉀氧化-比色法測(cè)定;土壤堿解氮、有效磷和速效鉀分別采用堿解擴(kuò)散-硫酸滴定法、碳酸氫鈉提取-鉬銻抗比色法和乙酸銨提取-原子吸收法測(cè)定.植物樣品采用HNO3-HClO4(5:1)消解,土壤樣品采用HNO3-HClO4-HF(5:4:1)消解,土壤中有效態(tài)Cd,Pb,Zn和Cu含量采用DTPA浸提(GB/T 23739-2009)[19],土壤有效態(tài)As含量采用0.5mol/L NaHCO3浸提[20],消解液和浸提液中Cd,Pb,Zn和Cu含量采用ICP-OES(等離子發(fā)射光譜儀,Thermo)測(cè)定,As含量采用雙道原子熒光光度計(jì)(AFS-2202E,北京海光儀器公司)測(cè)定.

土壤酶活性參照關(guān)松蔭[21]的方法測(cè)定:土壤脫氫酶活性測(cè)定采用紅四氮唑(TTC)比色法,脫氫酶活性單位為37℃下,24h內(nèi)土壤中三苯基甲臜(TPF) μg/g;土壤脲酶活性測(cè)定采用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定,脲酶活性單位為37℃下,24h內(nèi)土壤內(nèi)NH4+-N μg/g;土壤蔗糖酶采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定,以37℃下培養(yǎng)24h內(nèi)土壤中葡萄糖(glucose)mg/g;土壤酸性磷酸酶活性測(cè)定采用磷酸苯二鈉比色法,酸性磷酸酶活性單位為37℃下,3h內(nèi)土壤內(nèi)中酚(phenol)μg/g.

土壤DNA提取以及PCR-DGGE分析:土壤DNA提取根據(jù)土壤DNA提取試劑盒(Omega Bio-tek,US)說明書操作,-20℃保存.土壤DNA 16S和18S rDNA PCR擴(kuò)增程序分別參見Xiao等[22]和Xu等[23]的方法.然后取16S或18S PCR擴(kuò)增產(chǎn)物15μL,在聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%(100%的變性劑為7mol/L尿素和40%的去離子甲酰胺),變性劑梯度范圍 45%～70%(細(xì)菌)或30%～50%(叢枝菌根真菌),60℃下55V電泳14h(細(xì)菌)或 12h(叢枝菌根真菌).電泳結(jié)束后,采用 EB染色法(0.5μg/L)對(duì)凝膠染色 10min,然后用 Gel DOCTMXR+凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像(Bio rad,USA).

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行分析處理.采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和相關(guān)性分析.

構(gòu)樹體內(nèi)重金屬富集總量的計(jì)算根據(jù)如下公式:

式中:T地上部分、T地下部分和 T總和分別表示構(gòu)樹地上部分、地下部分和整株對(duì)某種重金屬的富集總量,mg;C葉、C莖和C根分別表示構(gòu)樹葉片、莖和根部的某種重金屬含量,mg/kg;B葉、B莖和B根分別表示構(gòu)樹葉片、莖和根的干重,g.

DGGE圖譜由Quantity One (version 4.6.2)進(jìn)行分析.香農(nóng)-維納指數(shù)(H)的度算根據(jù)式(4):

式中:ni為每個(gè)條帶的峰面積,N為所有條帶的總峰面積.均勻度指數(shù)(E)的計(jì)算公式為:

式中:S為每個(gè)泳道的條帶數(shù).采用CANOCO 5.0分析土壤環(huán)境因子與微生物群落之間的聯(lián)系.

2 結(jié)果與討論

2.1 構(gòu)樹對(duì)污染土壤中重金屬的富集特征

構(gòu)樹對(duì)污染土壤中重金屬的富集總量見圖 1.構(gòu)樹體內(nèi)As和Pb的富集總量隨修復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)無明顯變化,Cu的富集總量隨修復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),原因可能與植物根系長(zhǎng)時(shí)間與土壤重金屬直接接觸,植物采取一定的保護(hù)措施來降低污染土壤中重金屬對(duì)植物的毒害有關(guān)[24],進(jìn)而限制植物對(duì)污染土壤中As,Pb和Cu的富集.然而構(gòu)樹對(duì)Cd和Zn富集總量隨著修復(fù)時(shí)間呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(shì),且構(gòu)樹體內(nèi)對(duì)Cd和Zn的最大富集總量為2.26,66.8mg/pot,同時(shí),在修復(fù)270d后,地上部分Cd和Zn的富集總量與地下部分相當(dāng),分別可達(dá)1.17和38.2mg/pot.童方平等[15]研究表明銻礦區(qū)重金屬污染地4a生構(gòu)樹整株可富集1.99mg Cd和67.33mg Zn,與本研究結(jié)果相似.但賴發(fā)英等[16]表明每株一年生構(gòu)樹對(duì)污染土壤中Zn和Cu移除總量分別為32.51和6.67mg.本研究中構(gòu)樹對(duì)Cu的富集總量一般,原因可能與本研究污染土壤中存在多種重金屬離子,進(jìn)而導(dǎo)致植物對(duì)污染土壤中重金屬離子的選擇性吸收有關(guān)[25].研究表明,構(gòu)樹可有效富集污染土壤中的Cd和Zn,可用于Cd和Zn污染土壤修復(fù)與治理.

圖1 構(gòu)樹對(duì)污染土壤中重金屬的富集量隨時(shí)間的變化趨勢(shì)Fig.1 The total accumulation of heavy metals in B. papyrifera along with cultivation

2.2 構(gòu)樹生長(zhǎng)對(duì)污染土壤酶活性的影響

構(gòu)樹修復(fù)重金屬污染土壤過程中土壤脫氫酶、脲酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶活性隨著修復(fù)時(shí)間的變化見圖2.構(gòu)樹修復(fù)下,脫氫酶在4種酶活性中對(duì)復(fù)合污染土壤最為敏感,并隨著修復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)呈顯著下降并趨于平衡,與郭朝暉等[9]和 Liu等[26]的研究表明污染土壤中脫氫酶對(duì)重金屬比較敏感,并且植物修復(fù)難以恢復(fù)其正常酶活性,與本研究結(jié)果一致.整個(gè)修復(fù)期間,與無植物修復(fù)的土壤相比,構(gòu)樹修復(fù)下土壤脲酶活性無明顯變化;蔗糖酶活性和酸性磷酸酶活性在修復(fù) 90d時(shí)達(dá)到最大值 6.09mg glucose/(g·d)和192.4μg phenol/(g·3h),脲酶活性在修復(fù) 150d 時(shí)達(dá)到最大值 76.5μg NH4+-N/(g·d),隨后隨時(shí)間顯著下降,原因可能與污染土壤中重金屬對(duì)土壤酶活性具有一定程度的抑制作用有關(guān)[27].然而,構(gòu)樹修復(fù)270d后,土壤蔗糖酶和酸性磷酸酶活性顯著(P＜0.05)提高 3.12倍和 2.29倍.這可能是隨著修復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng),植物根系的生長(zhǎng)在一定程度上可緩解重金屬對(duì)土壤酶活性的抑制作用.植物修復(fù)過程中根系分泌各種有機(jī)酸、生長(zhǎng)激素等活性物質(zhì)[28],有利于污染土壤中微生物的生長(zhǎng)和活性的提高,從而直接或間接的改善土壤酶活性,與高揚(yáng)等[14]研究種植玉米可減輕Cd和Pb對(duì)土壤磷酸酶和脲酶的影響的結(jié)果一致.因此,構(gòu)樹修復(fù)有利于減弱土壤重金屬對(duì)土壤酶活性的毒害作用,維持土壤脲酶的正?；钚圆⒏纳仆寥勒崽敲负退嵝粤姿崦富钚?促進(jìn)污染土壤生物學(xué)特性的恢復(fù).

圖2 構(gòu)樹修復(fù)過程中土壤酶活性隨時(shí)間的變化趨勢(shì)Fig.2 Change of soil enzyme activities along with cultivation under B. papyrifera remediation

2.3 構(gòu)樹修復(fù)下污染土壤中重金屬有效態(tài)含量與酶活性的相關(guān)性分析

構(gòu)樹生長(zhǎng)下土壤中有效態(tài) As,Cd,Pb,Zn和 Cu含量隨著修復(fù)時(shí)間呈增加趨勢(shì)(表 2).在修復(fù)初期(0～150d),土壤中重金屬有效態(tài)含量均無顯著變化.修復(fù)270d后,土壤中有效態(tài)As,Cd,Pb,Zn和Cu含量與未修復(fù)的土壤(0d)相比分別提高 56.1%,9.21%,14.2%,19.0%和11.9%.同時(shí)土壤pH值隨修復(fù)時(shí)間呈下降趨勢(shì),且與土壤有效態(tài)Cd,Pb,Zn和Cu含量呈負(fù)相關(guān),其中與Zn和Cu呈顯著(P＜ 0.05)負(fù)相關(guān)(表3).由于構(gòu)樹根系活動(dòng)旺盛,可分泌大量根際分泌物如草酸、蘋果酸、檸檬酸和富里酸等,可一定程度降低土壤 pH值,使土壤中重金屬有效態(tài)含量顯著提高[29].然而,污染土壤中As,Cd,Pb,Zn和Cu有效態(tài)含量分別占總量的 0.87%～1.61%,55.34%～64.32%,34.93%～39.98%,24.69%～31.99%和25.15%～32.37%,其中土壤中 Cd,Pb,Zn和 Cu活性和含量都較高,植物修復(fù)無法在短時(shí)間內(nèi)有效提取和富集,因此必須輔助物理和化學(xué)措施來強(qiáng)化構(gòu)樹修復(fù)重金屬污染土壤.

表2 構(gòu)樹修復(fù)下污染土壤中pH值和重金屬有效態(tài)含量的變化Table 2 Changes of pH and heavy metals available contents in contaminated soil with B. papyrifera remediation

從表3可看出,構(gòu)樹修復(fù)下污染土壤中重金屬有效 態(tài)含量與脫氫酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性呈負(fù)相關(guān),其中土壤脫氫酶與有效態(tài)As,Cd,Pb,Zn和Cu含量,蔗糖酶與有效態(tài)Cd含量,以及磷酸酶與有效態(tài)Cd和Cu含量分別呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05),與Zeng等[30]得出的在植物修復(fù)下土壤中有效態(tài) Cd與土壤脫氫酶和脲酶呈顯著負(fù)相關(guān)的研究結(jié)果類似.重金屬對(duì)污染土壤酶活性的抑制主要表現(xiàn)為:①對(duì)土壤微生物的毒害效應(yīng);②與土壤酶的活性基團(tuán)結(jié)合;③與酶的底物基質(zhì)發(fā)生絡(luò)合反應(yīng);④對(duì)酶底物的競(jìng)爭(zhēng)性抑制[31].然而植物生長(zhǎng)過程中,污染土壤中重金屬離子對(duì)植物根系的刺激作用可促進(jìn)植物分泌大量的活性物質(zhì)和一些胞外酶等[28-29],同時(shí)植物的生長(zhǎng)也為根際微生物提供有利的生存空間,因此在植物和微生物共同作用下有效的改變根-土界面的生物化學(xué)環(huán)境,從而在一定程度的改善土壤酶活性[28,32],與Cui等[33]得出的海州香薷可改善Cd和Cu污染土壤的脲酶、過氧化氫酶和酸性磷酸酶活性的研究結(jié)果一致.

表3 構(gòu)樹修復(fù)下土壤pH值,酶活性和重金屬有效態(tài)含量的相關(guān)性分析Table 3 Relationship of soil pH, enzyme activities with the content of available heavy metals in soil

2.4 構(gòu)樹修復(fù)下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化

重金屬污染后土壤微生物數(shù)量和微生物的群落結(jié)構(gòu)可能發(fā)生顯著的變化[10,34].在構(gòu)樹修復(fù)重金屬污染土壤過程中,土壤微生物群落變化的DGGE圖譜見圖3.基于DGGE圖片每個(gè)條帶的強(qiáng)度,主要的細(xì)菌條帶隨著修復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)無明顯變化,但部分細(xì)菌條帶變?nèi)趸蚣訌?qiáng),這與Wu等[35]得出的在植物修復(fù)Ni污染土壤過程中主要細(xì)菌存在于整個(gè)修復(fù)周期并與植物形成特殊的群落結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果一致.而構(gòu)樹修復(fù)的不同期間,土壤中叢枝菌根真菌群落結(jié)構(gòu)具有較大差異,原因可能與植物生長(zhǎng)期、溫度、土壤重金屬的活性和其他環(huán)境因子有關(guān).構(gòu)樹修復(fù)下土壤細(xì)菌隨修復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)無明顯變化,而叢枝菌根真菌群落變化明顯,與Jia等[36]得出的在Cu污染土壤植物恢復(fù)過程中,不同修復(fù)時(shí)間下土壤中主要真菌群落及其組成具有較大的變化,而細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和相對(duì)豐度無明顯變化的研究結(jié)果一致.因此,構(gòu)樹修復(fù)重金屬污染土壤中微生物的適應(yīng)與演替在污染土壤的生態(tài)修復(fù)與重建過程中扮演重要的作用.

多樣性和均勻度指數(shù)被用來衡量一個(gè)生態(tài)環(huán)境中物種的多樣性和均勻性.構(gòu)樹修復(fù)下土壤中細(xì)菌和叢枝菌根真菌的香濃-威納多樣性和均勻度指數(shù)見表 4.與未修復(fù)的土壤(0d)相比,構(gòu)樹修復(fù)下(60～270d)土壤細(xì)菌和叢枝菌根真菌的均勻度指數(shù)無顯著差異,但其香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)得到提高,尤其是細(xì)菌多樣性指數(shù)顯著提高(P＜0.05),原因可能是植物在生長(zhǎng)過程中,可向根際土壤中釋放多種多樣的根系分泌物或植物根際碎片裂解物,這些化合物支撐著不同營(yíng)養(yǎng)需求的微生物生長(zhǎng)與繁殖[28].在構(gòu)樹修復(fù)的整個(gè)周期(60～270d),細(xì)菌和叢枝菌根真菌的香濃-威納多樣性指數(shù)均比較穩(wěn)定,這可能與土壤中微生物群落在長(zhǎng)期重金屬污染的環(huán)境下對(duì)重金屬產(chǎn)生了抗性、耐性或適應(yīng)性有關(guān)[37].因此,構(gòu)樹能有效改善重金屬污染土壤的微生物活性并維持土壤微生物多樣性的穩(wěn)定.

圖3 構(gòu)樹修復(fù)下土壤細(xì)菌和叢枝菌根真菌的DGGE圖譜Fig.3 DGGE profiles of bacteria and arbuscular mycorrhizal (AM) fungi in contaminated soil with B. papyrifera remediation

表4 構(gòu)樹修復(fù)下土壤微生物多樣性和均勻度指數(shù)Table 4 Microbial diversity and evenness index in soil remediated with B. papyrifera

將細(xì)菌和叢枝菌根真菌的DGGE圖譜數(shù)字化后,分別與環(huán)境因子結(jié)合進(jìn)行冗余分析(RDA),結(jié)果如圖4所示.RDA分析的軸1和軸2之和對(duì)土壤細(xì)菌和叢枝菌根真菌群落的解釋量分別為 69.42%和 61.29%,說明 RDA排序分析能較好的反應(yīng)土壤微生物(細(xì)菌和叢枝菌根真菌)與環(huán)境因子之間的關(guān)系.從圖4可看出,污染土壤中重金屬有效態(tài)含量對(duì)細(xì)菌和叢枝菌根真菌群落具有較強(qiáng)影響,尤其是有效態(tài)Cd,Zn和Cu對(duì)土壤中細(xì)菌和叢枝菌根真菌群落的影響較大,與大多數(shù)研究表明污染土壤中重金屬可改變土壤微生物的活性和組成的研究結(jié)果一致[10-11].而且土壤中脫氫酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶活性與重金屬有效態(tài)含量均呈負(fù)相關(guān),進(jìn)一步表明土壤中重金屬有效態(tài)含量對(duì)土壤酶活性的不利影響,與表3結(jié)果一致.從圖4可進(jìn)一步看出,土壤pH值與脫氫酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶活性具有較強(qiáng)的相關(guān)性,土壤 pH值的變化主要來源于構(gòu)樹修復(fù)重金屬污染土壤過程中根系分泌物(如檸檬酸、蘋果酸、富里酸等),進(jìn)而改善污染土壤酶活性,與Hou等[38]得出的東南景天可降低土壤pH值,提高土壤重金屬生物有效性,同時(shí)增加根際微生物的活性的研究結(jié)果一致.因此,構(gòu)樹有利于提高重金屬污染土壤的酶活性,同時(shí)提高土壤中微生物的活性,促進(jìn)共代謝作用,進(jìn)而有助于污染土壤的生態(tài)恢復(fù)與重建.

圖4 細(xì)菌和叢枝菌根真菌群落與環(huán)境因子的RDA排序圖Fig.4 RDA ordination diagram of bacteria and AM fungi communities associated with environmental factors

3 結(jié)論

3.1 盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明,構(gòu)樹可有效吸收污染土壤中Cd和Zn.經(jīng)270d培養(yǎng)后,構(gòu)樹地上部分Cd和Zn富集總量分別達(dá)1.17和38.2mg/pot.

3.2 構(gòu)樹修復(fù)可有效提高污染土壤酶活性和微生物多樣性.經(jīng) 270d培養(yǎng)后,構(gòu)樹修復(fù)污染土壤中蔗糖酶和酸性磷酸酶活性與未修復(fù)土壤相比顯著(P＜0.05)提高3.12倍和2.29倍.通過16S和18S rDNA PCRDGGE分析表明,構(gòu)樹修復(fù)可提高污染土壤中細(xì)菌和叢枝菌根真菌的多樣性,并維持污染土壤中微生物群落的穩(wěn)定.

3.3 構(gòu)樹修復(fù)可有效改善重金屬污染土壤的酶活性和微生物群落結(jié)構(gòu)等生物學(xué)特性,然而土壤重金屬有效態(tài)含量下降不明顯,必須輔助物理和化學(xué)措施來強(qiáng)化構(gòu)樹對(duì)重金屬污染土壤的生態(tài)修復(fù)效果.