李金貴，黃飚，萬華，陳仕高

成都市天府新區(qū)人民醫(yī)院1泌尿外科，2病理科，成都610213

膀胱癌主要發(fā)生于50～70歲的老年人群，年輕人群的膀胱癌發(fā)病率較低。早期膀胱癌患者的主要治療方式為手術(shù)治療，5年生存率較高，而晚期膀胱癌患者不僅需要接受膀胱全切術(shù)，還需要接受輔助放化療，并且復(fù)發(fā)率仍較高[1]。相關(guān)研究證實，正常細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細胞以及腫瘤細胞的浸潤、轉(zhuǎn)移過程受到多個基因的調(diào)控，而對于膀胱癌發(fā)病機制的研究也是目前臨床研究的重要方向[2]。線粒體融合蛋白2（mitofusion 2，MFN2）基因定位于人體1號染色體短臂36.22，亦稱增殖抑制基因（hyperplasia suppressor gene，HSG），極易出現(xiàn)缺失或異位等基因突變[3]。MFN2定位于線粒體外膜，對維持線粒體的正常功能和形態(tài)具有重要作用，并且與線粒體的融合功能關(guān)系密切。但目前關(guān)于MFN2在膀胱癌中的作用機制的研究較少。本研究探討了膀胱癌組織中MFN2基因和蛋白的表達變化及其臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月至2017年1月成都市天府新區(qū)人民醫(yī)院收治的80例膀胱癌患者的術(shù)后膀胱癌組織標本為膀胱癌組。納入標準[4]：①膀胱癌的診斷標準參考人民衛(wèi)生出版社《外科學(xué)》第七版中的標準；②均經(jīng)膀胱鏡取活組織檢測或術(shù)后病理學(xué)檢查確診為膀胱癌；③術(shù)前均未接受放化療及免疫治療。排除標準：①病歷資料不完整；②伴有其他部位惡性腫瘤者。選取同期于成都市天府新區(qū)人民醫(yī)院行手術(shù)切除的40例外傷患者的正常膀胱組織標本為對照組。其中膀胱癌組中，男69例，女11例；年齡45～81歲，平均（64.5±11.8）歲；病理分期：T2期47例，T3期33例；分化程度：高分化56例，中分化14例，低分化10例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例。對照組中，男34例，女6例；年齡40～79歲，平均（65.2±10.2）歲。兩組患者的性別、年齡一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 免疫組織化學(xué)法檢測

采用免疫組織化學(xué)法檢測膀胱癌組織和正常膀胱組織中MFN2蛋白的表達情況。10%甲醛固定后4℃過夜，脫水后二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋并切片，相關(guān)試劑盒購自北京奧維亞生物技術(shù)有限公司，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗為陰性對照，陽性對照由上海藥物研究所提供，高倍光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.3 RT-PCR技術(shù)

采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）技術(shù)檢測膀胱癌組織和正常膀胱組織中MFN2 mRNA的表達水平。取0.1 g膀胱組織，加入1mlTrizol試劑后經(jīng)氯仿抽提，加入異丙醇沉淀后獲取總RNA，RTPCR兩步法將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行擴增，PCR 產(chǎn)物 3 μl和DL2000 Marker凝膠電泳獲得mRNA表達圖像。

1.4 免疫組化結(jié)果判定標準

免疫組化結(jié)果判定：MFN2蛋白陽性表達于細胞質(zhì)，染色呈黃色、棕黃色、褐色。①根據(jù)細胞的著色強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，褐色、黑色為3分；②根據(jù)陽性細胞所占比例評分：陽性細胞所占比例＜1%為0分，陽性細胞所占比例為1%～10%為1分，陽性細胞所占比例為11%～50%為2分，陽性細胞所占比例為51%～75%為3分，陽性細胞所占比例＞75%為4分。將兩種積分相乘，總分＜3分為陰性，≥3分為陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或連續(xù)矯正χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MFN 2蛋白和mRNA表達情況的比較

膀胱癌組織中MFN2蛋白的陽性表達率為73.75%（59/80），明顯高于正常膀胱組織的15.00%（6/40），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=30.07，P＜0.01）；膀胱癌組織中MFN2 mRNA的相對表達量為（1.173±0.286），明顯高于正常膀胱組織的（0.392±0.104），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=16.70，P＜0.01）。（圖1）

圖1 不同組織中MFN 2蛋白的表達情況（免疫組化染色，×400）

2.2 MFN 2蛋白表達與膀胱癌患者臨床特征的關(guān)系

中低分化、T3期膀胱癌患者的膀胱癌組織中MFN2蛋白的陽性表達率分別高于高分化、T2期膀胱癌患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；不同年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移膀胱癌患者的膀胱癌組織中MFN2蛋白的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 膀胱癌組織中MFN 2蛋白表達與膀胱癌患者臨床特征的關(guān)系

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率居泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的第1位，男性與女性膀胱癌發(fā)病率的比例為5∶2[5-6]。目前，膀胱癌的發(fā)病機制尚未明確，通常認為與經(jīng)常接觸致癌物如萘胺、聯(lián)苯胺等有關(guān)，而日常生活中常見的染料、橡膠和塑料制品、油漆、洗滌劑等也有潛在的致癌危險。另外，相關(guān)研究表明，吸煙也會增加膀胱癌的發(fā)病風險[7-8]。此外，某些疾病如膀胱白斑、腺性膀胱炎、尿道結(jié)石、尿潴留等也可能會誘發(fā)膀胱癌[9]。

隨著免疫遺傳學(xué)和細胞分子生物學(xué)研究的不斷深入，關(guān)于惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展機制的研究取得了較大進步，但目前膀胱癌的發(fā)病機制仍不明晰，其流行病學(xué)及分子生物學(xué)研究仍處于初步推測階段。相關(guān)研究結(jié)果提示，相關(guān)基因及多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達異常與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展具有密切聯(lián)系，并證實線粒體分解蛋白活性與線粒體融合蛋白活性的相對平衡是保證線粒體功能正常的基礎(chǔ)[10]。結(jié)合相關(guān)研究，總結(jié)MFN2主要有以下幾類功能：①在早期胚胎發(fā)育及卵母細胞成熟分裂的過程中，MFN2蛋白及mRNA表達水平明顯增加，囊胚期表達量處于最高峰，進而參與卵母細胞的成熟分裂和組織發(fā)育過程[11]；②通過降低Rb磷酸化水平，抑制Ras-Raf-MEK-ERK1/2活化或抑制周期蛋白的表達來抑制細胞生長[12]；③在能力轉(zhuǎn)換和新陳代謝過程中誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡并抑制腫瘤細胞增殖[13]；④MFN2蛋白活性的增高可增強線粒體融合功能。這均提示MFN2基因與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程存在密切聯(lián)系[14]。

本研究結(jié)果顯示，膀胱癌組織中MFN2蛋白的陽性表達率明顯高于正常膀胱組織（P＜0.01）；膀胱癌組織中MFN2 mRNA的相對表達量明顯高于正常膀胱組織（P＜0.01）。提示膀胱癌組織中MFN2基因及蛋白表達上調(diào)明顯。這可能是由于腫瘤細胞生長需要消耗較多能量，因而需要線粒體不斷裂變、聚變并誘導(dǎo)細胞凋亡，而MFN2基因定位線粒體外膜，是介導(dǎo)線粒體融合所必需的蛋白質(zhì)，可參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)，因此膀胱癌組織中MFN2基因和蛋白的表達水平明顯升高。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中低分化、T3期膀胱癌患者的膀胱癌組織中MFN2蛋白的陽性表達率分別高于高分化、T2期的膀胱癌患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；不同年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移膀胱癌患者的膀胱癌組織中MFN2蛋白的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明MFN2與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。MFN2因細胞阻滯作用而抑制細胞的集落和增殖，進而削弱腫瘤細胞的侵襲和遷徙能力。此外，有研究結(jié)果表明，MFN2可上調(diào)PARPJI caspsase-3片段并將膀胱癌細胞阻滯于G2/M期，從而誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[15]。

綜上所述，膀胱癌組織中MFN2基因和蛋白的表達上調(diào)明顯，并且與膀胱癌患者的臨床特征有一定的關(guān)聯(lián)。